Protokolümüz, gen devresi tabanlı teşhisin tasarımını, montajını ve doğrulanmasını açıklar. Bu kağıt tabanlı moleküler teşhisler düşük maliyetli ve hassastır, klinik olarak ilgili nükleik asit konsantrasyonlarını tespit edebilir ve hemen hemen her sırayı tespit etmek için tasarlanabilir. Bu, kullanıcılar tarafından ihtiyaçları için tasarlanabilen ve klinik sınıf teşhisleri daha merkezi olmayan diş kaynağı ayarlarına getirme potansiyeline sahip bir platform teknolojisidir.
Hücresiz ayak parmağı tutma anahtarı sensörü, hemen hemen her nükleik asit bazlı hedef için tasarlanabilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Ebola, norovirüs, SARS-CoV-2, C.difficile ve tifoya neden olan bakteriler için hücresiz teşhis göstermiştir. Prosedürü gösterenler, doktora sonrası araştırmacı Severino Jefferson Rivero da Silva ve laboratuvarımdan doktora öğrencisi Pouriya Bayat olacak.
Ayak parmağı anahtarını tasarlamak için, Zika virüsü genomundan hedef dizileri tanımlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi amplikonlardan Zika virüsü hedef dizilerini seçin. Toehold switch tasarım yazılımı paketini indirin. MATLAB'ı açın ve tasarım yazılımı klasörüne gidin.
Hedef dizileri, giriş alt klasöründe bulunan tasarım giriş dosyası csv dosyasına girin. Tasarım işlevi için kullanılacak parametreleri seçin. İlgilenilen hedefler için ayak parmağı anahtarı tasarımlarını oluşturmak üzere tasarım işlevini çalıştırın.
Tamamlandığında, final_designs klasörüne gidin ve csv formatındaki elektronik tablolarda üst ayak parmağı anahtarı tasarım dizilerini ve ilgili hedef dizileri bulun. Algoritma tarafından üretilen ayak parmağı anahtarı DNA dizilerinin beş asal uçta T7 promotör dizilerini ve üç asal uçta korunmuş bir 21 nükleotid bağlayıcı dizisini içerdiğinden emin olun. Dizi homolojisini kontrol ederek üst ayak parmağı anahtarı tasarım dizilerini diğer yaygın virüslere karşı taramak için NCBI BLAST kullanın.
%40'tan az hemolojiye sahip dizileri kabul edin. Nükleaz içermeyen suda 10 mikromolar konsantrasyonunda ayak parmağı anahtarı saç tokası DNA oligolarının ve ters amplifikasyon primerlerinin çözeltilerini hazırlayın. PCR tüplerindeki reaksiyonları buz üzerinde bu tabloya göre birleştirin.
Reaksiyon tüplerini, bu tabloda listelenen döngü koşullarını izleyerek bir termosikletçiye yerleştirin. PCR ürünlerini bir agaroz jeli üzerinde analiz edin. PCR ürünlerini saflaştırın ve yeterince yüksek bir konsantrasyon sağlamak için DNA'yı minimum miktarda nükleaz içermeyen suda süzün.
DNA'yı bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın. Bir mililitre nükleaz içermeyen suda tozun 25 miligramını çözerek bir CPRG stok çözeltisi hazırlayın. Burada gösterilen standart protokole göre buz üzerinde bir ana karışım hazırlayın.
Hücresiz ana karışımı PCR tüplerine dağıtın. Hücresiz kontroller ve tek başına anahtarlı kontroller için, 5.94 mikrolitrelik bir hacme nükleaz içermeyen su ekleyin. Ve reaksiyon için, 33 nanomolar'ın son konsantrasyonunu elde etmek için PCR saflaştırılmış ayak parmağı anahtar DNA'sını ekleyin.
Ayak parmağı anahtarını ve hedef RNA kombinasyonunu test etmek için, in vitro transkribe edilmiş hedef RNA'yı bir mikromolar'ın son konsantrasyonuna ekleyin. Pipetleme ve santrifüj ile tüm reaksiyonları kısaca iyice karıştırın. Siyah berrak tabanlı 384 kuyucuklu bir plaka üzerinde, reaksiyon kuyularını çevreleyen kuyucuklara 30 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin.
Daha sonra iki milimetrelik bir biyopsi zımba ve cımbız kullanarak, BSA bloke filtre kağıdı disklerini kesin ve reaksiyon kuyularına yerleştirin. Her reaksiyon tüpünden 1,8 mikrolitreyi, 384 delikli plakadaki filtre kağıdı disklerine üçlü olarak dağıtın. Plakayı şeffaf PCR filmle örtün ve bir plaka okuyucuya yerleştirin.
Absorbansı 130 dakika boyunca her dakika 37 santigrat derecede 570 nanometrede ölçün. Nükleaz içermeyen suda tüm ileri ve geri astar setlerinden oluşan 25 mikromolar stok çözeltisi hazırlayın. Burada gösterilen ana karışımı kullanarak beş mikrolitrelik bir reaksiyon ayarlayın.
Beyaz çökelti çözünene kadar pipetleme ile karıştırın ve ardından PCR tüplerine dağıtın. İleri ve geri primerleri uygun tüplere ekleyin, ardından bir mikrolitre nükleaz içermeyen su veya iki pikomolar hedef tetikleyici RNA ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın ve tüpleri kısaca aşağı doğru döndürün.
Burada gösterildiği gibi bir termosikler üzerinde inkübasyon protokolünü ayarlayın. 12 dakika sonra, tüpleri çıkarın ve her tüpe 1.25 mikrolitre enzim karışımı ekleyin, ardından karıştırma ve santrifüjleme yapın. Bir saatlik reaksiyon inkübasyonuna başlamak için 41 santigrat derece tutma adımını atladıktan sonra tüpleri termosiklere geri döndürün.
Daha sonra astar performansını değerlendirmek için, kağıt bazlı hücresiz ayak parmağı anahtarı reaksiyonlarını bir araya getirin ve verileri analiz edin. Duyarlılık analizi için, aday primer çiftlerini tanımlayın ve nükleaz içermeyen suda hedef RNA'nın seri seyreltimlerini hazırlayın. NASBA ve hücresiz reaksiyonları, biyolojik üçlülerde seçilen astar setleriyle tekrarlayın.
Bir mikrolitre ekstrakte edilmiş hasta RNA'sı kullanarak, NASBA amplifikasyonunu ve kağıt bazlı hücresiz reaksiyonları beşinci bölümde gösterildiği gibi gerçekleştirin. Reaksiyonları takiben, 384 kuyucuklu reaksiyon plakasını hazırlayın ve tahlili 37 santigrat derecede taşınabilir bir plaka okuyucuda çalıştırın. Daha sonra RT-qPCR bileşenlerini birleştirin ve reaktifleri bu tabloya göre 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
Reaksiyonu pipetleme ile karıştırın. 96 delikli veya 384 delikli bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna 6,5 mikrolitre, ardından üçlü olarak her RNA şablonunun 3,5 mikrolitresini dağıtın. Plakanın üstüne bir PCR filmi yerleştirin.
384 delikli plakayı iki dakika boyunca 600 kez G'de santrifüj yapın. Plakayı bir RT-qPCR makinesine yerleştirin ve burada gösterildiği gibi bisiklet koşullarını çalıştırın. Hesaplamalı tasarımı takiben, üç ayak parmağı anahtarı inşa edildi ve agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi.
3.000 baz çifti civarında bir bant başarılı bir reaksiyona işaret etti. Ayak parmağı anahtarları, ilgili in vitro transkribe edilmiş tetik RNA'larına karşı değerlendirildi. Her üç sensör de absorbansta bir artış gösterirken, sensör 27B en hızlı açılma oranına sahipken, 33B ve 47B anahtarları arka plan aktivitesini ve azalmış özgüllüğü gösteren daha düşük bir açma / kapama oranına sahipti.
570 nanometredeki emmenin katlanma değişimi, 27B anahtarının açma / kapama sinyal oranıyla en iyi performansa sahip olduğunu gösterdi. Dahası, NASBA ile birleştiğinde, RNA'yı mikrolitre başına 124 molekül kadar düşük konsantrasyonlarda tespit edebilir ve bu da yüksek hassasiyeti gösterir. Brezilya'dan alınan Zika virüsü hasta örnekleri, taşınabilir bir plaka okuyucu kullanılarak sensörlerin klinik teşhis doğruluğunu değerlendirmek için test edildi.
Sarıdan mora renk değişikliği pozitif bir örnek tanımladı. Her kağıt tabanlı reaksiyon için kolorimetrik tepki, PLUM taşınabilir plaka okuyucusundaki entegre yazılım tarafından zaman içinde çizildi. Eşiği aşan örnekler pozitif olarak kabul edildi.
Sensörün klinik performansı RT-qPCR ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. Örnekler, döngü eşik değeri 38'e eşit veya daha küçük olduğunda pozitif olarak kabul edildi. Hasta denemelerine geçmeden önce ayak parmağı anahtar ekranlarından ve NASBA primer duyarlılığından elde edilen sonuçların tekrarlanabilir ve optimize edilebilir olmasını sağlamak önemlidir.
Sadeliği ve uyarlanabilirliği göz önüne alındığında, burada açıklanan teşhis platformu, özellikle düşük gelirli ülkeler için sağlık sistemine fayda sağlayabilecek yeni bakım noktası araçlarının geliştirilmesinin yolunu açmıştır.
