Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

ROS üretimini veya hücrelerdeki oksidatif stresi ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar arasında, 2'7'diklorofloresein diasetat probu, redoks durumunun doğrudan ölçülmesi için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu prob lipofilik ve floresan değildir. Bu probun hücre zarı boyunca difüzyonu, hücre içi esterazların iki ester bağında bölünmesine izin verir ve nispeten polar ve hücre zarı geçirimsiz bir ürün üretir. Bu floresan olmayan moleküller hücre içinde birikir ve daha sonra ROS tarafından oksidasyon, yüksek floresan ürün diklorofloresein verir. Probun oksidasyonu, çoklu ROS tipinin etkisinin ürünüdür. Akış sitometrisi veya konfokal mikroskopi ile tespit edilebilir. Bu yazıda, akış sitometrisi ile ROS'u ölçmek ve ölçmek için bir diklorofloresein diasetat probu kullandık. 6 delikli plakaları inkübatörden laminer bir akış davlumbazına aktarın. Süper natantı aspire edin. Ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Kuyu başına 2 mL düşük serum DMEM ekleyin. Ve 6 kuyucuklu plakayı inkübatörde iki saat boyunca inkübe edin. Hücreleri altı saat boyunca antioksidan ile tedavi edin. Hücreleri 30 dakika boyunca ROS indükleyici, A veya B ile tedavi edin. Süper natantı aspire edin. Ve tüm uyaranları gidermek için hücreyi PBS ile üç kez yıkayın. Laminer davlumbazın ışığını kapatın ve karanlıkta çalışın. DMEM'de fenol kırmızısı olmadan 1 mL diklorofloresein diasetat probu ekleyin. Kontrol otofloresan kontrol hücrelerine fenol kırmızısı olmadan 1 mL DMEM ekleyin. 6 kuyucuklu plakayı inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin. Buz üzerindeki plakaları laboratuvara aktarın. Hücreleri kuyu başına 2 mL soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 0,5 mL soğuk ayırma tamponu ekleyin. P1000 pipet kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipetle çekerek hücreleri toplayın. Bunları etiketli 1,5 mL tüpte toplayın. Ve onları 4 C'de beş dakika boyunca 600 x g'de santrifüj edin Süpernatantı dikkatlice atın ve peleti hafifçe kılavuz çekerek ayırın. Hücreleri etiketli her tüpe yıkamak için 1 mL FACS tamponu ekleyin. Gerekirse, peletin tamamen ayrışması için vorteksi en düşük yoğunlukta kullanın. Onları 4 C'de beş dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Toplamda üç yıkama. Hücre peletlerini 200 L FACS tamponunda yeniden askıya alın. Vorteks kullanarak her tüpteki peleti yavaşça tamamen ayırın. Ve akış sitometresi tüpleri için etiketli 5 mL'ye aktarın. Akış sitometresinde analiz edilene kadar tüpleri buz üzerinde tutun. Akış sitometrisi yazılımını kullanarak yeni bir deney oluşturun. Numuneye tıklayın ve bir tüp listesi açacaktır. Çift tıklayın ve yeniden adlandırın. Otofloresan kontrol tüpünü aspiratör koluna yerleştirin ve tabanı dikkatlice sadece sola doğru hareket ettirin. Veri Al'ı ve ardından Verileri Kaydet'i tıklatın ve istediğiniz durdurma koşulunu seçin. Ölü hücreler ve enkaz hariç, ilgilenilen hücrelerin etrafına bir kapı çizin. Tüpü çıkarın. Sonraki Tüp'e tıklayın ve bazal kontrol örneğini çalıştırın. Veri Al'ı tıklatın ve ardından Record Data.Open içinde yazılımı açın. Örnek Ekle eylem düğmesini kullanarak örnekleri ekleyin. Örnek Ekle.Deneysel Tarih klasörünü seçin ve Seç'i tıklatın.Çalışma alanınızdaki ilk örneği çift tıklatın, bu durumda otomatik floresan denetimi. Ölü hücreler ve döküntüler hariç, ilgilenilen hücreyi izole etmek için bir çokgen kapısı çizin. Grafiği histogram olarak değiştirin. M içinde çift tıklayın