Şekil 5'teki immünoblota yardım ettiği için Yanyang Bai'ye teşekkürler. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri [CRC-RS 950-232402 - AC] tarafından desteklenmiştir; Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 - AC]; İskoç Riti Yardım Vakfı [21103'ten AC'ye] ve Beyin Kanada Vakfı'ndan [AWD-023132'den AC'ye]; British Columbia Üniversitesi Aborijin Yüksek Lisans Bursu (6481'den MT'ye); Britanya Kolumbiyası Yüksek Lisans Bursu (6768'den MT'ye); Kanada Açık Sinirbilim Platformu Öğrenci Akademik Ödülü (10901'den JK'ya); British Columbia Üniversitesi Dört Yıllık Doktora Bursu (6569'dan JK'ya). Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Fare Beyni Histon Modifikasyonu Miktar Tayini

<ol>
	<li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans.">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Modifications+and+Their+Function.">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies.">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li><li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice.">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367 (2021).</li><li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation.">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li><li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications,+Long-Term+Potentiation,+and+Long-Term+Memory.">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li><li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development,+Homeostasis,+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner.">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li><li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation.">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science (New York, N.Y.). 356 (6344), eaal3222 (2017).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Microglia.">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li><li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Work+hard,+play+hard:+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior.">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011 (2022).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis:+An+Integrated+Protocol.">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li><li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence.">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients.">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li><li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer's+disease.">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation.">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li><li>P&#246;sel, C., M&#246;ller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain.">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658 (2016).</li><li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications:+A+MODEL-AD+Study.">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726 (2021).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70 (2019).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry.">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain.">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li><li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry.">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li><li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+in+the+brain:+measuring+global+histone+modifications.">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li><li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies.">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Sunulan protokol, akış sitometrisi yoluyla küresel HPTM seviyelerinin kantitatif değerlendirmesini sağlar. Bu protokol yeni bir yöntem sunarken, önceki çalışmalar benzer bir yaklaşım kullanarak proteinlerin kantitatif değerlendirmesini yapmıştır26. HPTM'lerin global düzeylerini değerlendirmek için kullanılan önceki yöntemler arasında immünohistokimya ve western blot 16,17,19,20 bulunmaktadır. Sunulan akış sitometrisi tabanlı yöntem kolayca ölçülebilir bir yöntem iken, western blot ve immünohistokimya yarı kantitatiftir ve daha düşük verime sahiptir. Western blot, hücre lizisine dayanır ve bu nedenle hem protein normalizasyonu hem de deneysel koşul27 tarafından değişmediği varsayılan bir yükleme kontrol proteini gerektirir. İmmünohistokimya yarı kantitatif ve çok düşük verimlidir, çünkü tek bir hücre düzeyinde inceleme yapmadan protein miktarını kantitatif olarak değerlendirmek zordur16. Benzer şekilde, izole edilmiş mikroglia için, western blot çok daha büyük protein girdisi gerektirdiğinden, sınırlı verim nedeniyle akış sitometrisi yöntemini kullanmanın bir faydası vardır19. Düşük hücre sayısı gereksinimleri, aynı hayvandan birden fazla boyama panelinin çalıştırılmasına izin verir.
Bununla birlikte, diğer herhangi bir yöntemde olduğu gibi, tüm antikorlar bir akış sitometrisi ortamında iyi çalışmadığından, antikor maliyeti ve kullanılabilirliği dahil olmak üzere bu tekniğin sınırlamaları vardır. Ek olarak, immünoblot ile karşılaştırıldığında, gerekli antikor konsantrasyonu çok daha yüksektir. Çoğullama, aynı hücre panelinde birden fazla antikorun kullanılmasına izin verirken, hücreler analizden sonra antikordan sıyrılamaz, böylece hücre kullanımını antikor türü başına bir tane ile sınırlandırır. Bu, aynı lekenin tekrar tekrar kullanılabileceği immünoblottan farklıdır. Bununla birlikte, antikorların mevcudiyetine ve bir sitometredeki tespit kanallarının sayısına bağlı olarak, aynı anda bir düzine kadar işareti incelemek mümkün olacaktır.
Mevcut yöntem, spesifik genomik konumu değil, yalnızca küresel protein ekspresyon seviyelerini yakalar ve küresel seviyelerdeki değişiklikler, bireysel genomik lokuslardaki değişiklikleri yansıtmayabilir. Benzer şekilde, küresel seviyelerde bir değişiklik olmaması, hiçbir genomik lokusun değişime uğramadığı anlamına gelmeyebilir, sadece küresel değişikliklerin tedaviler arasında hiçbir fark olmadığı anlamına gelir. Bu nedenle, bu tekniğin, genomik analiz için ilgilenilen HPTM'leri tanımlamak için bir ekran olarak kullanılması amaçlanmıştır. Ek olarak, bu yöntem, kontrol için bir kat değişikliği olarak değerlendirildiği durumlar dışında, farklı protein işaretleri arasında karşılaştırmaya izin vermez. Bu nedenle, protein tayini için ELISA gibi standart eğri tabanlı bir yöntemle karşılaştırıldığında bu sınırlıdır.
Sunulan protokol, canlı beyin mikrogliasını izole etmek için bir strateji sunmaktadır. Bu protokol, mikroglia izolasyonu için P2RY12 protein ekspresyonuna dayanır. Bununla birlikte, P2RY12, mikroglia'da homeostatik bir belirteçtir ve 5XFAD22 gibi hastalık modellerinde aşağı regüle edilebilir. Bu nedenle, bir hastalık modeli hayvanı kullanırken, mikroglia23'ün izolasyonuna yardımcı olmak için TMEM119, CD11b veya CD45 gibi diğer işaretleyici proteinleri seçtiğinizden emin olun. Benzer şekilde, bu protokolü hipokampus ve/veya korteksten izolasyon olarak sunuyoruz. Bu protokol, mikroglia'yı beyaz madde bölgeleri de dahil olmak üzere diğer beyin bölgelerinden izole etmek için çalışacaktır, ancak ilgilenilen bölgelerin büyüklüğüne bağlı olarak yeterli mikroglia elde etmek için birden fazla hayvan gerekebilir.
Sunulan protokol, canlı, beyin mikrogliasını sağlam bir şekilde izole edebilir, ancak izolasyon aşamasında, yanlış yapıldığında hücre verimini azaltabilecek aşağıda açıklanan birkaç adım vardır.
Bu protokol için perfüzyonlar, bağışıklıkla zenginleştirilmiş fragmanda daha yüksek bir mikroglia yüzdesi ile sonuçlanır ve bu da ayıklayıcıdaki süreyi azaltır. Bununla birlikte, perfüzyon gerekli değildir ve gerekirse diğer ötenazi yöntemleri kullanılabilir.
Mikroglia izolasyonu sırasında miyelin tamamen uzaklaştırılmalıdır. Akış sitometreleri, hücrelerin dar borulardan hızlı bir şekilde geçebilmesine dayanır. Viskozitesi ve topaklanma eğilimi nedeniyle miyelin, sitometrelerde sorunlara neden olur ve genellikle hem ekipmana zarar verebilecek hem de numuneyi tahrip edebilecek tıkanmalara neden olarak verimi büyük ölçüde azaltır. Aşağı akışta sorun yaşamamak için bağışıklıkla zenginleştirilmiş parçaların toplanması sırasında tüm miyelini çıkarmaya dikkat edin.
Tüp boyamaya karşı plaka boyama: Bu protokolde, 1.5 mL'lik tüplerde veya 96 oyuklu bir plakada hücreleri boyamak için iki seçenek tanımladık. Her birinin kullanım durumu denemeye bağlıdır; Bununla birlikte, genel olarak, tüp boyama, yanlış yapılırsa hareket hücre kaybı riski taşıdığından, verimi etkileme riski plaka boyamadan daha düşüktür. Her tüp için süpernatanı aspire etmek zaman alıcı olduğu için plaka boyama çok daha hızlıdır. Sabitlemeden önce (sıralama vb. için), verimi en üst düzeye çıkarmak ve kayıp riskini azaltmak için tüp boyama kullanın. Bununla birlikte, HPTM analizi için, hücreler intranükleer boyama için sabitlendikten sonra, pelet daha kararlıdır ve fiske ile kayıp riski azalır.
Süreksiz yoğunluk gradyanının oluşturulması: Katmanlamayı oluştururken, bağışıklıkla zenginleştirilmiş fraksiyonu elde etmek için katmanların uygun şekilde ayarlanması esastır. Katmanlar bozulursa veya karışırsa ve bulanık görünürse, hücreler istenen yerlerine göre sıralanmayacak ve bağışıklıkla zenginleştirilmiş hücre fraksiyonunun elde edilmesinde zorluk yaşanacaktır. Bu meydana gelirse, miyelini çıkarmak için yoğunluk ortamıyla döndürün ve ardından kalan tüm fraksiyonları toplayın, 3 mL FACS tamponu ile 1 mL yoğunluk ortamına seyreltin ve iyice karıştırın (bu, birden fazla tüp gerektirecektir). Fren 0 açıkken 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatanı atın, sadece ~ 300 μL çözelti bırakın. Tüm numuneyi toplayın ve boyayın. Bu, azaltılmış sıralama yüzdeleri ve sitometrede daha fazla zaman harcanmasına neden olacaktır, ancak verim yine de karşılaştırılabilir olabilir.
İzolasyon yöntemini kullanırken, aynı fare beyninden RNA ve HPTM değerlendirmesi için hücre toplayabilmek faydalıdır. Bu durumda, canlı mikrogliaları sıraladıktan sonra, hücreler RNA değerlendirmesine bir kısım tahsis etmek için bölünebilir (iyi bir RNA verimi elde etmek için minimum giriş sayısı 75.000 hücredir) ve daha ileri akış sitometrisi analizi için bir kısım (MFI'nin iyi belirlenmesi için kuyu başına minimum 10.000 hücre). Bu durumda, akış sitometresi sıralaması gereklidir. Bununla birlikte, hücreleri yalnızca HPTM analizi için kullanmayı planlarken, sıralama gerekli değildir ve bağışıklık fraksiyonu P2RY12 antikoru ve HPTM antikoru ile boyanabilir. Sitometre üzerindeki geçit daha sonra, mikroglia içindeki yalnızca HPTM sinyalini analiz etmek için akış sıralamasında olduğu gibi P2RY12+ mikroglia için ayarlanabilir. Sıralamayı ortadan kaldırmak, protokolün daha hızlı ve daha uygun maliyetli olmasını sağlar. Ek olarak, kültürlenmiş hücrelerden HPTM'ler değerlendiriliyorsa, boyama protokolünden başlamak yeterlidir ve Şekil 6'da gösterildiği gibi hücre marker antikorları gerekmez. HPTM değerlendirme protokolü, kültürlenmiş, birincil ve IPSC'den türetilmiş hücreler dahil olmak üzere birçok hücre tipi için kullanılabilir.
Son olarak, mikroglia'nın izolasyon aşağı akışında sadece iki potansiyel kullanımını sunmuş olsak da, ChIP, CUT & Tag ve CUT & RUN gibi epigenetik teknikler de dahil olmak üzere birçok başka kullanım vardır. Spesifik lokuslardaki değişikliklerin karakterize edilmesinin ilgi çekici olduğu genomik epigenetik teknikler söz konusu olduğunda, profillenen herhangi bir mikroglial epigenetik modifikasyonun, enzimatik sindirim gibi izolasyon prosedüründeki herhangi bir adımdan kaynaklanan teknik eserler olmadığından emin olmak için deneylere uyarlanmış kromatin işaretlerinin11 yazarları ve silgileri için spesifik inhibitörler seçin. Kantitatif akış sitometrisi kullanmak gibi epigenetik işaretlerin global seviyelerindeki değişiklikleri değerlendirirken, prosedüre bağlı herhangi bir değişikliğin global düzeyde tespit edilecek kadar büyük olması beklenmez.
Genel olarak, tartışılan yöntemler, akış sitometrisi ile küresel histon modifikasyon seviyelerini ve diğer epigenetik değişiklikleri ölçmek için yeni, tek hücreli bir yöntem sağlar. Bu yöntemin, in vivo LPS'ye yanıt olarak mikrogliadaki arttırıcı belirteç H3K27ac'deki küresel değişiklikleri tespit etmek için yeterince duyarlı olduğunu gösterdik. Bu, LPS28'e yanıt veren güçlendiricilerin dramatik bir şekilde yeniden şekillendiğini gösteren LPS stimülasyonunu takiben H3K27ac'nin önceki ChIP dizilimi ile tutarlıdır. Bu yöntemin uygulamaları, gelişim ve hastalıktaki farklı beyin hücresi tiplerinde küresel epigenetik değişikliklerin incelenmesine izin verecektir.

Epigenetik, altta yatan DNA dizisini değiştirmeden gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmaların incelenmesidir. Gen ekspresyonunun epigenetik regülasyonu hücreler içinde dinamiktir ve çeşitli çevresel uyaranlara hızlı ve koordineli tepkilere izin verebilir. Dinamik düzenleme kısmen, DNA1 tarafından sıkıca sarılmış bir oktamer çekirdeğe monte edilmiş histon proteinlerinden (H2A, H2B, H3, H4) oluşan nükleozom seviyesindeki kromatin yapısındaki değişiklikler nedeniyle meydana gelir. Histon proteinleri ve DNA arasındaki etkileşimler, DNA'nın transkripsiyon mekanizmasına erişilebilirliğini kontrol edebilir, bu da sonuçta gen ekspresyonunu ve kromatin biyolojisinin diğer yönlerini kontrol edebilir2. Histon proteinleri, negatif yüklü DNA omurgası ile elektrostatik etkileşimler oluşturan pozitif yüklü kalıntılara sahip yapılandırılmamış kuyruklara sahiptir. Bu etkileşimler, DNA'nın sıkı bir şekilde paketlenmesine ve DNA erişilebilirliğinin azalmasına neden olur. Histon kuyruklarında histon sonrası translasyonel modifikasyonlar (HPTM'ler) olarak adlandırılan kovalent modifikasyonlar, bu etkileşimleri düzenleyebilir 3,4. En iyi karakterize edilmiş HPTM'lerden bazıları, histon kuyrukları ve DNA arasındaki elektrostatik etkileşimlerin afinitesini değiştirebilen, altta yatan DNA'ya farklı erişilebilirlik ve bu HPTM'leri belirli bölgelerde tanıyan transkripsiyon faktörlerinin işe alınmasına neden olan histon kuyruğu asetilasyonu ve metilasyonunu içerir. HPTM'ler, HPTM'leri kaldıran okuyucular, biriktiren yazarlar ve silgiler olarak adlandırılan üç önemli enzim sınıfı tarafından düzenlenir. Bu nedenle, okuyucu, yazıcı veya silgi enzimlerinin işe alınması veya çözülmesi, nihayetinde HPTM'lerin manzarasını değiştirebilir ve kromatinin yapısını ve işlevini yönetebilir, bu da hücresel biyolojiyi ve işlevi anlamak için bunların düzenlenmesini ve okunmasını gerekli kılar 3,4.
Merkezi sinir sistemindeki (CNS) hücreler, çevresel uyaranlara uyum sağlamak için transkriptomlarını değiştirdikleri için epigenetik olarak esnektir. Biriken kanıtlar, DNA metilasyonu, kodlamayan RNA'lar ve HPTM'ler gibi epigenomdaki değişikliklerin hafıza oluşumunda ve sinaptik fonksiyonda önemli bir rol oynadığını göstermektedir5. İlgili okuyucuların, yazarların veya silgilerin manipülasyonu yoluyla HPTM dinamiklerini bozmak, ilişkisel öğrenmeyi ve uzun vadeli güçlendirmeyi engelleyebilir veya geliştirebilir 6,7,8. CNS'nin yerleşik bağışıklık hücresi olan mikroglia, epigenomlarındaki dinamik değişiklikler yoluyla bağışıklık stimülasyonuna yanıt olarak transkriptomlarını hızla düzenler 9,10,11. Çalışmalar, mikroglia'nın epigenomunun ve transkriptomunun, beyin ortamından çıkarıldıktan sonra kültür ortamında sadece birkaç saat sonra değiştiğini gösterdiğinden, yerel beyin ortamlarına bu yüksek düzeyde adaptasyon, onları izole bir bağlamda incelemeyi zorlaştırmaktadır11. Ek olarak, mikroglia beyin hücrelerinin sadece %10'unu oluşturduğundan, tüm doku seviyesindeki değişiklikleri inceleyen ölçümler duyarlılık ve özgüllükten yoksundur12,13. Sonuç olarak, HPTM seviyeleri, ex vivo gibi epigenetik değişiklikleri incelemek için mikroglia'nın hızla izole edilmesi gerekir.
HPTM'leri incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında kromatin-immünopresipitasyon dizilemesi (ChIP-seq) ve hedefler altında bölünme ve etiketleme dizilimi (CUT & Tag-seq) bulunur4. Bu teknikler bireysel bir HPTM'ye oldukça spesifik olsa ve belirli bir genomik bağlamda HPTM'lerin varlığını bildirebilse de, tek bir deneyde birçok olası HPTM'den yalnızca birini inceleyebilirler11,14 Bu nedenle, önemli bir zaman ve para yatırımı gerektiren bu tür deneylere geçmeden önce, küresel olarak yapılan değişiklikleri inceleyerek daha fazla araştırma için potansiyel olarak ilginç HPTM'lerin listesini daraltmak son derece değerlidir. HPTM seviyeleri. Global HPTM düzeylerini incelemek için iki ana yaklaşım immünohistokimya ve western blot analizidir, ancak her iki yaklaşım da yalnızca yarı kantitatiftir, düşük verimlidir ve çok sayıda doku kesiti veya izole hücre gerektirir 15,16. Böylece, global HPTM düzeylerini hızlı ve tek hücre düzeyinde incelemek için kullanılabilecek son derece hassas, kantitatif bir yöntem geliştirmeyi amaçladık.
Sunulan protokol, intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel HPTM seviyelerinin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Kanser hücrelerinde yapılan önceki çalışmalar, küresel düzeylerin klinik bir bakış açısıyla incelenmesinin önemini haklı çıkarmıştır17,18. İlgilenilen spesifik HPTM'lerin genomik konumunu değerlendirmeden önce global düzeyleri bir tarama yöntemi olarak kullanan çalışmalar da yaygındır19,20. Mikroglia için, düşük hücre verimi nedeniyle izolasyonu takiben küresel seviyeleri değerlendirmek zordur; Pan ve arkadaşları, western blot19 ile protein seviyesinin saptanmasını sağlamak için üç hayvandan alınan mikrogliaların bir araya getirildiği izole mikrogliadan küresel HPTM seviyelerini sunar. Protokolümüzü kullanarak, çok daha düşük hücre girdileri ile küresel değişiklikleri tespit edebiliyoruz, hayvan başına birden fazla işaretin taranmasını sağlıyoruz ve numuneleri havuzlama ihtiyacını ortadan kaldırıyoruz.
Burada, izole mikroglialarda kantitatif intranükleer akış sitometrisi yoluyla HPTM seviyelerini hızlı bir şekilde tespit etmek için bir protokol açıklıyoruz. Kısalık uğruna özellikle HPTM miktar tayinine odaklanırken, bu protokol okuyucu, yazar ve silgi enzimlerinin küresel seviyelerini ölçmek için aynı şekilde kullanılabilir. Protokol iki kısımda sunulur: birincisi, mikroglia için izolasyon yöntemi ve ikincisi, HPTM seviyelerini belirlemek için akış sitometrisi tabanlı yöntem. İzolasyon yöntemi, aynı numuneden gen ekspresyonu ve HPTM seviyelerinin değerlendirilmesine izin veren hem RNA izolasyonu hem de HPTM seviyesi değerlendirmesi için kullanılabilecek hücreler verir. Ek olarak, HPTM değerlendirme yöntemi, protokolde belirtildiği gibi diğer hücre tiplerinde de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Not Treated Plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>9649S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone H4 K8 (2594)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>2594S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>8173S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA523516</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>15021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>2222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (tri methyl K4)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab213224</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM Biolabs</td>
			<td>PTM-1411RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb</td>
			<td>PRM Biolabs</td>
			<td>PTM-1401RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>848006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyto-Last Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, sterile</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>12611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Mouse AlexaFluor488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-546-150</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AS035</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>406410</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB12566502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K18ac Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>720095</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6002</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM BIolabs</td>
			<td>PTM-1406RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>LK003178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC57004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptolide</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>97539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Nuclear Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>424401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>156604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of global histone post translational modifications using intranuclear flow cytometry in isolated mouse brain microglia

Gen ekspresyon kontrolü, kısmen, histon kuyruklarına posttranslasyonel modifikasyonların eklenmesi ve çıkarılması dahil olmak üzere kromatin yapısındaki modifikasyonlarla gerçekleşir. Histon translasyon sonrası modifikasyonlar (HPTM'ler), gen ekspresyonunu veya baskılanmasını kolaylaştırabilir. Örneğin, histon kuyruğu lizin kalıntılarının asetilasyonu, pozitif yükü nötralize eder ve kuyruk ile negatif yüklü DNA arasındaki etkileşimleri azaltır. Histon kuyruk-DNA etkileşimlerindeki azalma, altta yatan DNA'nın erişilebilirliğinin artmasına neden olarak transkripsiyon faktörü erişiminin artmasına izin verir. Asetilasyon işareti ayrıca bromodomain içeren transkripsiyonel aktivatörler için bir tanıma bölgesi görevi görür ve birlikte gelişmiş gen ekspresyonu ile sonuçlanır. Histon işaretleri, hücre farklılaşması sırasında ve farklı hücresel ortamlara ve uyaranlara yanıt olarak dinamik olarak düzenlenebilir. Yeni nesil dizileme yaklaşımları, bireysel histon modifikasyonları için genomik konumları karakterize etmeye başlamış olsa da, aynı anda sadece bir modifikasyon incelenebilir. Yüzlerce farklı HPTM olduğu göz önüne alındığında, daha kapsamlı genom dizileme yaklaşımları gerçekleştirmeden önce histon modifikasyonlarını taramak için kullanılabilecek yüksek verimli, nicel bir küresel HPTM ölçüsü geliştirdik. Bu protokol, global HPTM'leri tespit etmek için akış sitometrisi tabanlı bir yöntemi tanımlar ve kültürdeki hücreler veya in vivo dokulardan izole edilmiş hücreler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bakteri kaynaklı bir bağışıklık uyaranına (lipopolisakkarit) yanıt olarak HPTM'lerdeki küresel kaymaları tespit etmek için testin duyarlılığını göstermek için izole fare beyni mikrogliasından örnek veriler sunuyoruz. Bu protokol, HPTM'lerin hızlı ve kantitatif değerlendirmesine izin verir ve bir antikor tarafından tespit edilebilen herhangi bir transkripsiyonel veya epigenetik düzenleyiciye uygulanabilir.

Epigenetics is the study of the mechanisms that regulate gene expression without altering the underlying DNA sequence. Epigenetic regulation of gene expression is dynamic within cells and can allow for rapid and coordinated responses to various environmental stimuli. The dynamic regulation occurs in part due to changes in the chromatin structure at the level of the nucleosome, which is comprised of histone proteins (H2A, H2B, H3, H4) assembled into an octamer core tightly wound by DNA1. The interactions between the histone proteins and the DNA can control the accessibility of DNA to transcription machinery, which can ultimately control gene expression and other aspects of chromatin biology2. Histone proteins have unstructured tails which feature positively charged residues that form electrostatic interactions with the negatively charged DNA backbone. These interactions result in tight packing of the DNA and reduced DNA accessibility. Covalent modifications to the histone tails, termed histone post-translational modifications (HPTMs), can regulate these interactions3,4. Some of the most well-characterized HPTMs include histone tail acetylation and methylation, which can change the affinity of electrostatic interactions between the histone tails and DNA, resulting in differential accessibility to the underlying DNA and recruitment of transcription factors which recognize these HPTMs at specific sites. HPTMs are regulated by three important classes of enzymes termed readers- which recognize, writers- which deposit, and erasers- which remove HPTMs. Thus, the recruitment or dissolution of reader, writer, or eraser enzymes can ultimately change the landscape of HPTMs and govern the structure and function of chromatin, making their regulation and readout essential for understanding cellular biology and function3,4.
The cells in the central nervous system (CNS) are epigenetically flexible as they change their transcriptome to adapt to environmental stimuli. Accumulating evidence suggests that changes in the epigenome, such as DNA methylation, non-coding RNAs, and HPTMs, play an essential role in memory formation and synaptic function5. Disrupting HPTM dynamics through manipulation of the relevant readers, writers, or erasers can block or enhance associative learning and long-term potentiation6,7,8. Microglia, the resident immune cell of the CNS, rapidly regulate their transcriptome in response to immune stimulation through dynamic changes in their epigenome9,10,11. This high level of adaptation to their local brain environment makes them difficult to examine in an isolated context as studies have shown that the epigenome and transcriptome of microglia becomes altered after only a few hours in culture media after removal from the brain environment11. In addition, as microglia only make up 10% of the brain&#39;s cells, measures examining changes at the whole tissue level lack sensitivity and specificity12,13. As a result, microglia need to be rapidly isolated to examine the epigenetic changes such as HPTM levels, ex vivo.
The methods commonly used to examine HPTMs include chromatin-immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) and cleavage under targets and tagmentation sequencing (CUT&#38;Tag-seq)4. While these techniques are highly specific to an individual HPTM and can inform the presence of HPTMs within a specific genomic context, they can only examine one of the many possible HPTMs within a single experiment11,14 Therefore, before proceeding with such experiments, which require a significant time and money investment, it is highly valuable to narrow down the list of potentially interesting HPTMs for further investigation by first examining changes in global levels of HPTMs. The two main approaches for examining global HPTM levels are immunohistochemistry and western blot analysis, but both approaches are only semi-quantitative, low-throughput, and require large numbers of tissue sections or isolated cells15,16. Thus, we aimed to develop a highly sensitive, quantitative method that could be used to examine the global HPTM levels rapidly and at the single cell level.
The protocol presented enables detection of global HPTM levels rapidly using intranuclear flow cytometry. Previous studies in cancer cells have justified the importance of examining global levels from a clinical perspective17,18. It is also common for studies to use global levels as a screening method prior to assessing genomic location of specific HPTMs of interest19,20. For microglia, assessing global levels following isolation is challenging due to the low cell yield; Pan et al present global HPTM levels from isolated microglia, in which microglia from three animals was pooled to enable protein level detection by western blot19. Using our protocol, we are able to detect global changes with much lower cell inputs, enabling screening of multiple marks per animal and eliminating the need to pool samples.
Here, we describe a protocol to detect HPTM levels rapidly via quantitative intranuclear flow cytometry in isolated microglia. While we focus specifically on HPTM quantification for the sake of brevity, this protocol can be used in the same way to quantify global levels of reader, writer, and eraser enzymes. The protocol is delivered in two parts: first, the isolation method for microglia and, second, the flow cytometry-based method for determining HPTM levels. The isolation method yields cells that can be used for both RNA isolation and HPTM level assessment which allows for the evaluation of gene expression and HPTM levels from the same sample. In addition, the method for HPTM assessment can be used on other cell types as indicated in the protocol.

Yazar Spotlight: Gen İfadesi Düzenleme Araştırmasındaki Gelişmeler

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Our research aims to understand the fundamental regulatory mechanisms controlling gene expression in the brain, and we're particularly interested in understanding how disruption of these mechanisms contributes to neurodevelopmental and neuropsychiatric conditions. We focus on understanding how genetic and environmental risk factors combined to alter cellular function and produce behavioral impairments. This protocol includes methods for high-throughput screening of histone modifications in isolated microglia, allowing us to screen through dozens of different epigenetic modifications before committing to high-throughput sequencing, and functional follow-up studies.Our protocol provides measures of global histo modifications similar to Western plot. However, our technique is both faster, requires fewer input cells, is more quantitative, and can be multiplexed.

Yetişkin fareler transkardiyal olarak perfüze edildi ve mikroglia izolasyonu için sakfiye edildi. Mikroglia buz üzerinde izole edildi ve P2RY12-APC ve violet 525 canlı ölü antikorları ile boyandı. P2RY12 pozitif, violet 525 canlı ölü lekesi için negatif olduğu belirlenen hücreler canlı mikroglia olarak sınıflandırıldı. Diseke bir fare beyninden ortalama mikroglia verimi 1.28 x 105 ± 0.05 idi (ortalama ± standart hata ortalaması (SEM), N = 100). Dişi (1.25 x 105 ± 0.09 [ortalama ± SEM, N=46]) ve erkek (1.32 x 105 ± 0.07 [ortalama ± SEM, N=54]) farelerden mikroglia verimi açısından bir fark yoktur (t(98)=0.6365, p=0.526). Belirli beyin bölgelerinden izole edilirken, fare kortekslerinden ortalama mikroglia verimi 8.3 x 104 ± 0.08 (ortalama ± SEM, N = 15) ve fare hipokampusundan 4.1 x 104 ± 0.02'dir (ortalama ± SEM, N = 16). Beklendiği gibi, her beyin bölgesinden mikroglia veriminde önemli bir fark vardır (F(2, 128)=25.25, P<0.0001). Mikroglia izolasyonunu takiben, düşük girdili bir RNA izolasyon kiti kullanılarak izole edilen hücrelerden RNA ekstrakte edildi. Tutarlı bir şekilde RNA bütünlük skoru (RIN) 9.0'ın üzerindeydi (9.62 ± 0.05) ve hücre başına ortalama RNA verimi 0.25 ± 0.01 pg idi (ortalama ± SEM, N = 32; Ek Dosya S2).
Yetişkin farelere, kurban edilmeden 24 saat önce intraperitoneal olarak 1 mg / kg lipopolisakkarit (LPS) enjekte edildi. Fareler, HBSS ile transkardiyal olarak perfüze edildi ve mikroglia, tarif edilen protokole göre tüm beyinden izole edildi (Şekil 5A). Her leke için, her bir antikor paneline 20.000-30.000 hücre tahsis edildi. Histon 3 lizin 27 asetilasyonunun (H3K27Ac) global seviyeleri, akış sitometrisi ile izole mikrogliada değerlendirildi. Erkek ve dişi fareler için, MFI cinsiyet içinde normalleştirildiğinde LPS tedavisi H3K27Ac'de artışa neden oldu (t (6) = 9.676, p < 0.0001; Şekil 5B). Boyanmış hücreler için histogramlar incelendiğinde, popülasyonlar benzer varyasyonlarla normal olarak dağılmış olarak kalır; bununla birlikte, hücreler MFI'de artışa neden olan artan floresansa kaymıştır (Şekil 5C). Aynı tedavide H3K9Ac incelendiğinde de benzer bir artış vardır (t(6)=7.299, p=0.0003; Şekil 5D,E), ancak LPS'nin H3K9Ac sinyalinin PBS'sine göre kat değişimi, H3K27Ac sinyalinden daha azdır.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Şekil 5: İzole mikrogliadaki histon asetilasyonundaki global değişiklikler. (A) Fareler, kurban edilmeden 24 saat önce intraperitoneal olarak fosfat tamponlu salin (PBS) veya 1 mg / kg lipopolisakkarit (LPS) enjekte edilir. Mikroglia, immün kuvvetle zenginleştirilmiş fraksiyondan toplanır ve akış sitometrisi ve global histon translasyon sonrası modifikasyon değerlendirmesi için sabitlenir. Medyan floresan yoğunluğu, protein ekspresyonu için bir vekil olarak değerlendirilir. BioRender.com ile oluşturuldu. (B) LPS tedavisine yanıt olarak küresel H3K27Ac seviyeleri artmıştır. Deney ve cinsiyet içinde normalleştirilmiş PBS'ye katlama değişikliği. Eşlenmemiş iki kuyruklu t-testi, t(6)=9.676, p<0.0001. Çubuk grafik, ortalama ± SEM'i gösterir. N = 8 hayvan; 2 bağımsız deneyde koşul başına 2. (C) H3K27Ac floresan yoğunluğunun kaymasını gösteren örnek histogramlar. Modal, PBS enjekte edilen ve LPS enjekte edilen farelerden alınan histogramları gösterir. (D) H3K9Ac floresan yoğunluğunun kaymasını gösteren örnek histogramlar. Modal, PBS enjekte edilen ve LPS enjekte edilen farelerden alınan histogramları gösterir. (E) LPS tedavisine yanıt olarak küresel H3K9Ac seviyeleri artmıştır. Deney ve cinsiyet içinde normalleştirilmiş PBS'ye katlama değişikliği. Eşlenmemiş iki kuyruklu t-testi, t(6)=7.299, p=0.0003. Çubuk grafik, ortalama ± SEM'i gösterir. N = 8 hayvan; 2 bağımsız deneyde koşul başına 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Açıklanan yöntemin, global histon modifikasyon ölçümü için daha önce kullanılan diğer yöntemlerle karşılaştırılabilir olduğunu doğrulamak için, karşılaştırmalı bir araç olarak immunoblot'u kullanmayı amaçladık. Bununla birlikte, izole edilmiş mikrogliadan elde edilen verim, makul bir değerlendirme sağlamak için çok düşüktür. Bu nedenle, hücre içi akış sitometrisi yöntemini Western blot (WB) ile karşılaştırmak için kültürlenmiş BV2 hücreleri kullandık. BV2 hücreleri, 37 ° C,% 5 CO2'de tam ortamda (DMEMF12,% 10 FBS, 1x penisilin / streptamisin ve 1x L-glutamin) büyütüldü. Hücreler% 0.25 tripsin-EDTA ile pasajlandı ve 250.000 hücre / kuyu yoğunluğunda kaplandı ve indirgenmiş serum ortamında (DMEM F12,% 2 FBS, 1x penisilin / streptamisin ve 1x L-glutamin) muamele edildi ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 12 saat iyileşmeye bırakıldı. Hücreler, yukarıda tarif edildiği gibi fiksasyondan veya bir WB lizis tamponu ile lizisten önce 24 saat boyunca 25 ng / mL LPS ile muamele edildi. H3K27Ac'nin sinyali, WB için bir yükleme kontrolü olarak kullanılan GAPDH ile her iki yöntemle de gerçekleştirildi. Her grup için PBS kontrolüne kıyasla normalleştirilmiş floresan yoğunluğunun analizi belirlendi (Şekil 6A). WB ile normalize H3K27Ac sinyalindeki değişiklik incelendiğinde, eşlenmemiş t-testi ile anlamlı olduğu belirlenenH2Okontrolüne göre LPS ile tedavi edilen durumda 1.527 kat artış vardı (t=3.024, df=5; p=0.0293). Akış sitometrisi kullanılarak değişiklik incelendiğinde, LPS ile tedavi edilen durumda anlamlı olduğu belirlenen 1.482 kat artış vardı (t = 7.843, df = 10; p<0.0001). Yöntemlerin karşılaştırılmasında 2 yönlü varyans analizi (F(1,15)=45.21,p<0.0001) tedavinin anlamlı bir etkisinin olduğu, ancak yöntemin (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) veya etkileşimin (F(1,15)=0.02785, p=0.8697) anlamlı bir etkisinin olmadığı belirlendi. Ek olarak, 2 yönlü ANOVA'nın LPS tedavisinin (F(1,7)=0.02170,p=0.8870), yöntemin (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) veya etkileşimin (F(1,7=0.01191, p=0.9162; Şekil 6B). Bu veriler için örnek lekeler ve histogram kaymaları da gösterilmiştir (Şekil 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Şekil 6: Akış sitometrisi ve western blot arasındaki global histon modifikasyon değişikliğinin nicelleştirilmesi için yöntem karşılaştırması. (A) BV2 hücreleri, analizden önce 24 saat boyunca 25 ng / mL lipopolisakkarit (LPS) veyaH2Oile muamele edilir. H3K27Ac'nin floresan yoğunluğu, hem akış sitometrisi hem de western blot için araç kontrolü, fosfat tamponlu salin (PBS) kat değişikliği olarak tasvir edilir. 2 yönlü varyans analizi (F(1,15)=45.21, p<0.0001) anlamlı etki gösterirken, yöntem (F(1,15)=0.05545, p=0.8697) veya etkileşim (F(1,15)=0.02785, p=0.8697) anlamlı etki göstermedi. Kalıntılar için Tukey'in çoklu hipotez testi düzeltmesi uygulanmıştır. * 0.0332, ** 0.0021 sunar. (B) Histon H3 için floresan yoğunluğu, hem akış sitometrisi hem de western blot için PBS'ye kat değişikliği olarak tasvir edilir. 2 yönlü varyans analizi, LPS tedavisinin (F(1,7)=0.02170, p=0.8870) veya yöntemin (F(1,7)=0.01191, p=0.9162) veya etkileşimin (F(1,7=0.01191, p=0.9162) anlamlı bir etkisini göstermedi. (C) Örnek lekeler ve (D) akış sitometrisi kaymaları tasvir edilmiştir. Histogram boyutu, mod floresan yoğunluğunda bulunan hücre sayısına bağlı olarak yüzde olarak normalleştirilir. Çubuk grafik, ortalama SEM'i gösterir. n=2 bağımsız deney, deney başına koşul başına 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hep birlikte, bu sonuçlar, bu tekniğin izole mikrogliadaki küresel HPTM seviyelerini kantitatif olarak değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Ek olarak, yöntemin önceki tekniklerle karşılaştırılabilir olduğu, ancak çok daha düşük hücre girdileri gerektirdiği gösterilmiştir. Ek olarak, gösterilmemiş olsa da, uygun kompanzasyonla, mevcut teknik, farklı HPTM'leri değerlendiren aynı panelde birden fazla antikorla kullanılabilir.
Ek dosya S1: Örnek analiz dosyaları. Bu dosya, bir wsp analiz dosyası ve lekesiz, P2RY12FMO, 568FMO, iki PBS ile tedavi edilmiş hayvan ve H3K27Ac ile boyanmış iki LPS ile muamele edilmiş hayvan dahil olmak üzere 7 fcs dosyası içerir. Bu dosyanın amacı, başarılı bir deneyin nasıl göründüğünü gösterebilecek bir deney üzerindeki analizi ve geçitleri göstermektir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya S2: İzolasyon verileri. Dahil edilen dosya, açıklanan protokolden mikroglia ve RNA verimini içeren mikroglia sıralaması sonrası ilgili verileri içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>GÜVENLIKLI NÜFUS</td>
			<td>Ebeveyn Sıklığı</td>
			<td>Toplam Frekans</td>
			<td>Saymak</td>
		</tr><tr><td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2>S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ > S2 > S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ > APC+ > S2 > S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Örnek örnek soy tablosu, doğru protein tespiti için gereken yüzdeyi ve olay sayılarını gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancements in Gene Expression Regulation Research at JoVE.com

Bu çalışma, izole beyin mikrogliasında intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel histon modifikasyonlarının ölçülmesi için bir protokolü açıklamaktadır. Çalışma ayrıca veri toplama için kullanılan mikroglia izolasyon protokolünü de içermektedir.

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Araştırmamız, beyindeki gen ekspresyonunu kontrol eden temel düzenleyici mekanizmaları anlamayı amaçlamaktadır ve özellikle bu mekanizmaların bozulmasının nörogelişimsel ve nöropsikiyatrik koşullara nasıl katkıda bulunduğunu anlamakla ilgileniyoruz. Genetik ve çevresel risk faktörlerinin hücresel işlevi değiştirmek ve davranışsal bozukluklar üretmek için nasıl bir araya geldiğini anlamaya odaklanıyoruz. Bu protokol, izole mikrogliadaki histon modifikasyonlarının yüksek verimli taranması için yöntemler içerir ve yüksek verimli dizileme ve fonksiyonel takip çalışmalarına başlamadan önce düzinelerce farklı epigenetik modifikasyonu taramamıza olanak tanır.Protokolümüz, Batı komplosuna benzer küresel tarih değişikliklerinin ölçümlerini sağlar. Bununla birlikte, tekniğimiz hem daha hızlıdır, hem daha az giriş hücresi gerektirir, hem daha niceldir hem de çoğullanabilir.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

633 Görüntüleme.  University of British Columbia. Araştırmamız, beyindeki gen ekspresyonunu kontrol eden temel düzenleyici mekanizmaları anlamayı amaçlamaktadır ve özellikle bu mekanizmaların bozulmasının nörogelişimsel ve nöropsikiyatrik koşullara nasıl katkıda bulunduğunu anlamakla ilgileniyoruz. Genetik ve çevresel risk faktörlerinin hücresel işlevi değiştirmek ve davranışsal bozukluklar üretmek için nasıl bir araya geldiğini anlamaya odaklanıyoruz. Bu protokol, izole mikrogliadaki histon modifikasyonların...

Video: Yazar Spotlight: Gen İfadesi Düzenleme Araştırmasındaki Gelişmeler

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

Nörobilim

Mouse Brain Dissection for Microglia Isolation

Begin by placing the isolated mouse brain tissue in 1 milliliter of digestion buffer per brain in separate Petri dishes on ice. Thoroughly chop the brain tissues into small pieces using a clean scalpel blade. Using a plastic transfer pipette with its tip cutoff, carefully transfer minced brains into individual wells inside a 24-well plate on ice.Cover the plate with a large piece of transparent, flexible film, close the lid, and incubate on ice for 30 minutes. Next, transfer the digested brain solution into individual 7-milliliter iced glass dounce homogenizers on ice containing 5 milliliters of cold FACS buffer. Gently dounce each brain with a loose pestle until a single-cell suspension is obtained.Softly dounce with the tight pestle three to four times to ensure a single-cell suspension before transferring to 15-milliliter polypropylene tubes.

Mikroglia İzolasyonu için Fare Beyin Diseksiyonu

Mouse Brain Immune-Enriched Fragment Isolation for Histone PTM Quantification

Begin by adding 2.125 milliliters of isotonic density gradient to a 15 milliliter polypropylene tube containing murine brain homogenate. Top up each tube with fax buffer to a final volume of 8.5 milliliters. Gently invert the tubes 20 times to mix thoroughly.Using a narrow graduated transfer pipette, gently underlay four milliliters of pink, 37%density gradient establishing two clean layers. Switch transfer pipettes and underlay two milliliters of the blue, 70%density gradient below the 37%layer. Transfer the tubes to a centrifuge cool to four degrees Celsius and spin them at 500 G for 20 minutes with the braking ramp set to the lowest setting.After centrifugation, discard the myelin from the top of the 15 milliliter tube using a clean transfer pipette. Carefully collect the top fragment of the density gradient into a clean 15 milliliter polypropylene tube using another transfer pipette. Next, gather all cells in the sample by slowly circling the pipette along the sides of the tube while collecting the immune enriched fragment.Transfer the immune enriched fragment into a new 15 milliliter polypropylene tube. Wash the sample by adding 10 milliliters of fax to the tube. Gently invert the tube 20 times to mix thoroughly.Spin the tubes in a cooled centrifuge with the braking ramp set to the lowest setting to pellet the isolated immune cells.

Histon PTM Miktar Tayini için Fare Beyni İmmünle Zenginleştirilmiş Fragman İzolasyonu

Mouse Brain Enriched Immune Pellet Plate Staining Method for Histone Quantification

Transfer a mouse brain enriched immune pellet from a 15-milliliter tube to a round bottom 96-well plate. After centrifuging the plate at 500 G for five minutes, Remove the supernatant by flicking. Resuspend the cells in 100 microliters of FACS buffer, then transfer 10 microliters from each well into the control wells.Centrifuge at 500 G for five minutes. After removing the supernatant from the centrifuged cells, add 50 microliters of double concentration FC block. Incubate for 10 minutes on ice.Now add 50 microliters of the antibody master mix at double the final desired concentration and incubate it on ice in the dark. Then, add 200 microliters of the FACS buffer to each well and centrifuge at 500 G for five minutes. Discard the supernatant by flicking, then wash the cells in 300 microliters of FACS buffer.Centrifuge and resuspend the cells in 200 microliters of FACS buffer. Finally, transfer the suspension to a flow sort tube containing 300 microliters of FACS buffer.

Histon Ölçümü için Fare Beyni Zenginleştirilmiş Bağışıklık Pelet Plakası Boyama Yöntemi

Flow Cytometry and Data Analysis of Murine Brain Histone Post-Translational Modifications

Analyze the antibody panel, confirm that the cytometer has a minimum of four lasers, including red, yellow, blue, and violet. Establish the compensation matrix with either compensation beads or single stain cell controls. To calibrate and standardize, run rainbow fluorescent beads at the beginning of each experiment by adjusting the photomultiplier tube voltage until the bead peaks align with the target values from the previous experiments.Set the photomultiplier tube voltage and gain for the experiment. Then use antibody captured compensation beads to establish a compensation matrix. Next, plot the side scatter area on log versus the forward scatter height on linear in a dot plot, gate out debris and select for cell size using the S1 gate, choose singlet cells in a dot plot a forward scatter width versus forward scatter height with S2 gate.For establishing floor four gates, use the relevant FMO for each floor four channel. With single parameter histograms determine the positive signal in each channel and establish the gates accordingly. Carefully record the samples using the established gating strategy.Identify microglia using P2 RY 12 plus signal and determine protein expression in the respective channel for microglia only. Establish analysis gates on the cytometer analysis software user interface by replicating the same gating strategy used during recording. Use the add statistics function to select the median for the population of interest on the compensated channel height.Export the MFI values for the respective channels to a spreadsheet using the table editor for further statistical analysis. Lipopolysaccharide treatment induced an increase in histone three lysine 27 acetylation. When the MFI is normalized within sex, histogram analysis of the stained cells showed normally distributed populations with cell shifts to increased fluorescence.A similar increase in histone three lysine 27 acetylation was seen in the stained cells.