Geçici göz içi basıncı yükselmesine dayalı sağlam ve ilerleyici glokom dejenerasyonunu indüklemek için basit bir yöntem geliştirdik. Bu, glokom patofizyolojisinin kilit noktalarını incelemek için eşsiz bir fırsattır. Bu, her deney için daha az sayıda hayvan kullanarak in vivo fonksiyon analizine ve kısa vadeli deneysel tasarımlara olanak tanıyan, öğrenmesi kolay, invaziv olmayan, düşük maliyetli ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir modeldir.
Retina ve optik sinir, merkezi sinir sisteminin değerlendirilebilir parçalarıdır, bu nedenle bu yapıların ilerleyici bozukluğunun modellenmesi, diğer nörodejeneratif bozukluklar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Hem deneysel hem de kontralateral kontrol gözlerinin başlangıç göz içi basıncını veya GİB'sini ölçmek için, anestezi uygulanmış sıçanı, kornea yüzeyine tonometrenin ucuna kolayca erişilebilecek şekilde tezgah üstünde ventral dekübit pozisyonuna yerleştirin. Tonometre ucunu, merkezi kornea bölgesine dik olarak hafifçe dokunacak şekilde konumlandırın.
Ardından, ölçüm düğmesine basarak ölçümü alın. Daha sonra, fareyi stereo mikroskop altında hafif bir yanal dekübit pozisyonuna yerleştirin ve deney gözünü 40 kat büyütmede inceleyin. İşlem sırasında, bir damla karmeloz sodyum veya sodyum hiyalüronat damlatılarak kontralateral kontrol gözünü yağlayın.
Daha sonra, kavisli forseps kullanarak, limbusun 360 derecesini çevreleyen damar sistemini ortaya çıkarmak için deneysel göz küresini hafifçe ileri doğru itin. Daha sonra, diğer elinizle, düşük sıcaklıkta bir oftalmik koter kullanarak, korneanın etrafındaki damarları nazikçe dağlayın. Kornea çevresini dağlamamaya dikkat edin.
Ameliyat edilen gözde skleral limbusta küçük dairesel koterizasyon izlerinin ortaya çıkışını, limbal vaskülatürün obliterasyonunu ve pupil genişlemesini gözlemleyerek cerrahi prosedürün başarısını doğrulayın. Ameliyattan sonra, daha önce gösterildiği gibi her iki gözde de ameliyat sonrası GİB'yi kontrol edin. Ardından, deneysel gözün ön yüzeyine bir damla oftalmik prednizolon asetat uygulayın.
40 saniye sonra, oftalmik bir antibiyotik merhem ile değiştirin. Steroid olmayan bir antienflamatuar ilaç ve antibiyotik merhemden oluşan topikal ilaçlarla deneysel gözün günlük klinik takibini uygulayın. Optomotor tepki analizi için, fareyi dörtgende dört bilgisayar monitörü ile oluşturulmuş bir platforma alıştırma için yerleştirin.
Sanal silindirin merkezini gösterdiğinden, video karesindeki kırmızı artı imlecini serbestçe hareket eden farenin gözleri arasında tutun. Dönen derecelendirmeler tarafından ortaya çıkarılan sıçan başının ve boynunun refleksif bir takibinden oluşan optomotor tepkiyi gözlemleyin. Başlangıçta, düşük uzamsal frekansa sahip bir uyaran tanıtın, ardından izleme hareketi fark edilmeyene kadar frekansı kademeli olarak artırın.
Model elektroretinogramını kaydetmek için, sıçanı uyuşturduktan sonra, aktif elektrodu korneanın temporal çevresine dikkatlice yerleştirin. Ek olarak, referans elektrodu ipsilateral temporal kantusun deri altı dokusuna ve toprak elektrodunu arka bacaklardan birine yerleştirin. Ardından fareyi uyaran ekranından 20 santimetre uzağa konumlandırın, sinyal taban çizgisini izleyin ve toplama sistemindeki Analiz düğmesine basarak alımı başlatın.
Retinaları izole ettikten sonra, iç retinayı yukarı bakacak şekilde bir mililitre PBS içeren 24 oyuklu bir kültür plakasına aktarın. PBS ile seyreltilmiş% 0.5 iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ile yıkayarak dokuyu geçirgenleştirin. Daha sonra, dokuyu ve bloke edici çözeltiyi oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, Brn-3a birincil antikor çözeltisini hazırlayın ve dört santigrat derecede saklayın. Doku blokajından sonra, retinaları 200 mikrolitre primer antikor çözeltisinde dört santigrat derecede 72 saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Sonra, mendili PBS ile yıkayın.
Dokuyu 200 mikrolitre ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin ve daha sonra floresan çekirdeklerin boyanması için 10 dakika boyunca nükleer karşı boyama çözeltisi ile inkübe edin. Üç PBS yıkamasından sonra, retinayı vitreus tarafı yukarı bakacak şekilde iki küçük fırça kullanarak bir cam mikroskop lamına aktarın. Dorsal retinal kadranı mikroskop lamı üzerinde yukarı doğru konumlandırın.
Son olarak, 200 mikrolitre antifade montaj ortamını bir cam kapak kızağı üzerine uygulayın ve mikroskobik analiz için düz monte edilmiş retinaya yerleştirin. Konfokal epifloresan mikroskobu altında, 40 kat büyütücü bir objektif kullanarak, retinal ganglion hücrelerini tahmin etmek için düz bağlantıları inceleyin. Göz küresi enükleasyonundan sonra, göz içi kısmın bir kısmı da dahil olmak üzere optik sinirin intraorbital kısmının proksimal segmentini çıkarın.
Ardından, numuneleri hemen 200 ila 300 mikrolitre soğuk fiksatif içeren şişelere veya tüplere yerleştirin. İki saat sonra, dokuyu soğuk 100 mikromolar sodyum kakodilat tamponu ile yıkayın. Daha sonra, dokuyu bir saat boyunca% 1 osmiyum tetroksit ve beş nanomolar kalsiyum klorür içinde dört santigrat derecede hafifçe çalkalayın.
Soğuk sodyum kakodilat tamponu ile üç yıkamadan sonra, optik sinir parçalarını gece boyunca inkübe etmeden önce soğuk damıtılmış su ve dört santigrat derecede% 1 pisuar asetat ile yıkayın. Ertesi gün, suyla üç yıkamadan sonra, artan aseton konsantrasyonlarında dokuyu kademeli olarak kurutun. Ardından, dokuyu 24 saat boyunca saf epoksi reçineye gömmeden önce üç tur gömme ve epoksi reçine aseton solüsyonu gerçekleştirin.
Ertesi gün, numuneleri numune taşıyıcıdan çıkarın ve 60 santigrat derecede 48 saat boyunca gömme kalıplarına aktarın. Polimerizasyondan sonra, optik sinir parçalarının enine yarı ince kesitlerini kesmek için bir ultra mikrotom kullanın. Ardından, bölümleri toplayın ve bir mikroskop cam lamına aktarın.
Bölümleri toluidin mavisi ile boyayın ve 100 kat büyütmede optik mikroskop kullanarak görüntüleyin. Ultra yapısal analiz için, ultra ince kesitler yapın ve bunları bakır bir ızgara üzerinde toplayın. Ardından, transmisyon elektron mikroskobik incelemesi için bölümleri pisuar asetat ve kurşun sitrat ile boyayın.
Tam daire koterizasyon, kontrol gözlerine kıyasla ameliyattan hemen sonra GİB yükselmesine neden oldu. Postoperatif GİB için pik birinci günde gözlendi ve altıncı günde kademeli olarak başlangıç seviyelerine düştü. Ayrıca, retina fonksiyonu sırasıyla optomotor refleks ve patern elektroretinogram kullanılarak hem davranışsal hem de elektrofizyolojik olarak değerlendirildi.
Ameliyattan sonra, her iki parametre de iki farklı bozulma fazı gösterdi: üçüncü günde oküler hipertansiyon akut fazı ve 30. günde sekonder dejenerasyon fazı. Kontrol optik sinirleri ile karşılaştırıldığında, aksonal sayılar ve yarı ince transversal optik sinir kesitleri ameliyattan sonra progresif olarak azaldı. Kontrol gözünden optik sinirlerin transmisyon elektron mikrografları, ince glial hücre süreçleri ve belirgin aksonal mikrotübüller ve nörofilamentler ile ayrılmış yoğun paketlenmiş miyelinli lifler gösterdi.
Buna karşılık, üç günlük oküler hipertansiyondan sonra, birkaç dejenere lif, glial hücre süreçlerinde sitoplazmik vakuolasyon ve glial hücre çekirdeklerinde yoğunlaştırılmış kromatin gözlendi. Yedi gün sonra, dejenere aksonal liflerde ve hipertonik glial hücre süreçlerinde bir artış oldu. Ve 14 gün sonra, aksonlar arasında glial hücre süreçlerinin istilası ile ilişkili optik sinir liflerinde daha fazla düzensizlik gözlendi.
Ayrıca, retinal ganglion hücrelerinin yoğunluğu zamanla özellikle dorsal ve temporal retinal kadranlarda azalmıştır. Bu işlemi gerçekleştirirken, kord çevresini koruyarak ve skleral limbusun her yerinde sürekli koterizasyon izlerinin görülmesini sağlamak için koter ucu ile limbal damarlara hafifçe dokunmaya çalışın. Bu işlemi takiben göz yapılarının fonksiyonel biyokimyasal ve immünohistokimyasal değerlendirilmesi ve glokom fizyopatolojisi üzerine geçerli olabilecek diğer yöntemler gibi çeşitli yöntemler uygulanabilir.
