Desenvolvemos um método simples para induzir degeneração robusta e progressiva do glaucoma baseado na elevação temporária da pressão intraocular. Isso representa uma oportunidade única para estudar pontos-chave da fisiopatologia do glaucoma. Trata-se de um modelo de fácil aprendizado, não invasivo, de baixo custo e altamente reprodutível, que permite a análise in vivo da função e o planejamento experimental de curto prazo utilizando um número reduzido de animais para cada experimento.
A retina e o nervo óptico são partes avaliáveis do sistema nervoso central, de modo que a modelagem do comprometimento progressivo dessas estruturas pode fornecer informações valiosas sobre outras doenças neurodegenerativas. Para medir a pressão intraocular basal, ou PIO, dos olhos controles experimentais e contralaterais, coloque o rato anestesiado em decúbito ventral na bancada, de modo que a superfície corneana seja facilmente acessível à ponta do tonômetro. Posicione a ponta do tonômetro de forma que ela toque levemente a zona corneana central perpendicularmente.
Em seguida, adquira a medição pressionando o botão de medição. Em seguida, colocar o rato em leve decúbito lateral sob estereomicroscópio e inspecionar o olho experimental em aumento de 40 vezes. Durante o procedimento, mantenha o olho de controle contralateral lubrificado instilando uma gota de carmelose sódica ou hialuronato de sódio.
Em seguida, usando pinça curva, empurre suavemente o globo ocular experimental para frente para expor a vasculatura ao redor de 360 graus do limbo. Em seguida, com a outra mão, usando um cautério oftálmico de baixa temperatura, cauterizar suavemente os vasos ao redor da córnea. Cuidado para não cauterizar a periferia da córnea.
Confirmar o sucesso do procedimento cirúrgico observando o surgimento de pequenas marcas circulares de cauterização no limbo escleral, a obliteração da vasculatura limbal e a dilatação pupilar no olho operado. Após a cirurgia, verificar a PIO no pós-operatório imediato em ambos os olhos, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, aplicar uma gota de acetato de prednisolona oftálmica na superfície anterior do olho experimental.
Após 40 segundos, substitua-o por uma pomada antibiótica oftálmica. Aplicar um acompanhamento clínico diário do olho experimental com medicamentos tópicos compostos por um anti-inflamatório não esteroidal e pomada antibiótica. Para análise da resposta optomotora, colocar o rato para habituação em uma plataforma construída com quatro monitores de computador em um quadrângulo.
Mantenha o cursor de cruz vermelha no quadro de vídeo entre os olhos do rato em movimento livre, pois indica o centro do cilindro virtual. Observar a resposta optomotora que consiste em um rastreamento reflexivo da cabeça e pescoço do rato provocado pelas graduações rotatórias. Inicialmente, introduzir um estímulo com baixa frequência espacial, em seguida, aumentar a frequência progressivamente até que o movimento de rastreamento não seja notado.
Para registrar o eletrorretinograma padrão, após anestesiar o rato, insira cuidadosamente o eletrodo ativo na periferia temporal da córnea. Além disso, insira o eletrodo de referência no tecido subcutâneo do canto temporal ipsilateral e o eletrodo terra em um dos membros posteriores. Em seguida, posicione o rato a 20 centímetros da tela de estímulo, monitore a linha de base do sinal e inicie a aquisição pressionando o botão Análise no sistema de aquisição.
Após o isolamento das retinas, transferi-las para uma placa de cultura de 24 poços contendo PBS de um mililitro, mantendo a retina interna voltada para cima. Permeabilizar o tecido lavando com um tensoativo não iônico a 0,5% diluído em PBS. Em seguida, incubar o tecido e a solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave.
Durante a incubação, preparar a solução primária de anticorpos Brn-3a e armazenar a quatro graus Celsius. Após o bloqueio tecidual, incubar as retinas em 200 microlitros de solução de anticorpos primários a quatro graus Celsius por 72 horas com agitação suave. Em seguida, lave o lenço de papel com PBS.
Incubar o tecido em 200 microlitros da solução de anticorpos secundários por duas horas à temperatura ambiente e, em seguida, com solução de contracoloração nuclear por 10 minutos para coloração de núcleos fluorescentes. Após três lavagens com PBS, transfira a retina para uma lâmina de microscópio de vidro usando duas pequenas escovas mantendo o lado vítreo para cima. Posicione o quadrante dorsal da retina para cima na lâmina do microscópio.
Finalmente, aplique 200 microlitros de meio de montagem antifade em uma tampa de vidro e coloque-o na retina plana montada para análise microscópica. Sob um microscópio confocal de epifluorescência, usando uma objetiva de aumento de 40 vezes, examine as montagens planas para estimar as células ganglionares da retina. Após a enucleação do globo ocular, remover o segmento proximal da porção intraorbital do nervo óptico, incluindo parte da porção intraocular.
Em seguida, coloque imediatamente as amostras em frascos ou tubos contendo 200 a 300 microlitros de fixador a frio. Após duas horas, lavar o tecido com tampão cacodilato de sódio 100 micromolar frio. Em seguida, pós-fixar o tecido por uma hora em tetróxido de ósmio a 1% e cloreto de cálcio nanomolar a quatro graus Celsius sob agitação suave.
Após três lavagens com tampão cacodilato de sódio frio, lavar os fragmentos do nervo óptico com água destilada fria antes de incubar durante a noite e acetato de mictório a 1% a quatro graus Celsius. No dia seguinte, após três lavagens com água, desidratar progressivamente o tecido em concentrações crescentes de acetona. Em seguida, realizar três rodadas de incorporação e soluções de acetona de resina epóxi antes de incorporar o tecido em resina epóxi pura por 24 horas.
No dia seguinte, retire as amostras do porta-amostras e transfira-as para moldes de incorporação por 48 horas a 60 graus Celsius. Após a polimerização, use um ultramicrótomo para cortar cortes transversais semifinos dos fragmentos do nervo óptico. Em seguida, colete e transfira as seções para uma lâmina de vidro do microscópio.
Coloração dos cortes com azul de toluidina e obtenção de imagens em microscópio óptico com aumento de 100 vezes. Para análises ultra-estruturais, execute seções transversais ultrafinas e colete-as em uma grade de cobre. Em seguida, corar os cortes com acetato de mictório e citrato de chumbo para exame de microscopia eletrônica de transmissão.
A cauterização completa induziu elevação da PIO imediatamente após a cirurgia em comparação com os olhos controles. O pico da PIO pós-operatória foi observado no primeiro dia e diminuiu gradualmente até os níveis basais no sexto dia. Além disso, a função retiniana foi avaliada comportamental e eletrofisiologicamente usando reflexo optomotor e eletrorretinograma padrão, respectivamente.
Após a cirurgia, ambos os parâmetros mostraram duas fases distintas de comprometimento: hipertensão ocular fase aguda no terceiro dia e fase de degeneração secundária no 30º dia. Em comparação com os nervos ópticos de controle, as contagens axonais e as secções semifinas do nervo óptico transversal diminuíram progressivamente após a cirurgia. Micrografias eletrônicas de transmissão de nervos ópticos do olho controle demonstraram fibras mielinizadas densamente embaladas separadas por processos de células gliais finas e microtúbulos axonais e neurofilamentos evidentes.
Em contraste, após três dias de hipertensão ocular, algumas fibras degeneradas, vacuolização citoplasmática em processos de células gliais e cromatina condensada em núcleos de células gliais foram observadas. Após sete dias, houve aumento das fibras axonais degeneradas e dos processos hipertônicos das células gliais. E após 14 dias, observou-se maior desarranjo das fibras do nervo óptico associado à invasão de processos celulares gliais entre os axônios.
Além disso, a densidade de células ganglionares da retina diminuiu com o tempo, principalmente nos quadrantes dorsais e temporais da retina. Durante a realização deste procedimento, tente tocar suavemente os vasos límbicos com uma ponta de cautério, poupando a periferia do cordão e garantindo que marcas de cauterização contínua sejam observadas ao redor do limbo escleral. Após esse procedimento, uma variedade de métodos pode ser aplicada, como a avaliação bioquímica funcional e imuno-histoquímica das estruturas oculares e outros métodos que possam ser reconhecidos na fisiopatologia do glaucoma.
