Eksozomlar, 14 ila 200 nanometre büyüklüğündeki bir hücre tarafından salgılanan veziküllere reaksiyona girebilir ve hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubuna gelen hücre içi kargo ve iletişimden ayrılabilir. Endozomun farklılaşması sonucu oluşan eksozomlar hücre zarından köken alırlar. Kök hücreler, kemik iliği veya yağ dokuları gibi farklı kaynaklardan izole edilebilir.
ancak yetişkin dokusunda kurutulmuş kök hücrelerin immünojenik potansiyelinin daha yüksek olduğu Eksozomların büyüklüğü nedeniyle, kan beyin bariyerine geçebildiği için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli bir rol oynadığı söyleniyor. Başlamak için, tohumlanmış Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerini beş mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, şişeyi bir inkübatöre yerleştirmeden önce beş mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri toplayın ve beş dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı çıkarın ve% 10 FBS içeren bir mililitre DMEM-F12 tüpe ekleyin. Kültürlenmiş hücreleri PBS ile yıkayın.
Yıkadıktan sonra, hücrelere serum içermeyen DMEM-F12 besiyeri ekleyin ve inkübatöre yerleştirin. Eksozomları izole etmek için, serum içermeyen ortamı toplayın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı başka bir tüpe aktarın ve daha yüksek hızlarda seri santrifüjleme ile işleyin.
Son santrifüjlemeden sonra, süpernatanı yavaşça çıkarın ve peleti bir mililitre PBS'de çözün. Vorteksleme ile karıştırın ve dört santigrat derecede 70 dakika boyunca 110.000 G'de ultrasantrifüjlemeye devam edin. Daha önce ultrasantrifüjleme ile toplanan eksozom süspansiyonuna üç mililitre PBS ekleyin ve seyreltilmiş süspansiyonu 0.22 mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyerek sterilize edin.
Daha sonra 500 mikrolitre sterilize edilmiş eksozom süspansiyonunu başka bir tüpe aktarın. Daha sonra sırayla, sterilize edilmiş süspansiyona mililitre dopamin çözeltisi ve saponin başına 500 mikrolitre 0.5 miligram ekleyin. İnkübasyondan sonra süspansiyonu ultrasantrifüjleyin.
Numune, dopamin yüklü eksozomları karakterize etmek için NTA ve DLS analizi için kullanılabilir veya daha fazla kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. NTA analizinde Wharton jöle türevi eksozomların ortalama büyüklüğü 98 nanometre, dopamin yüklü eksozomların ise 110 nanometre olduğu belirlenmiştir. NTA ve DLS analizleri ile ortaya çıkan nanopartikül sayıları birbirleri ile tutarlıydı.
Wharton jöle türevi eksozomların zeta potansiyeli eksi 15.7, dopamin yüklü eksozomların ise eksi 17.6 milivolt olarak ölçülmüştür. Dopamin yüklü eksozomların HPLC analizi, dopamin için zirveyi 6.45 dakikada tespit etti. Kümülatif ilaç salım profili, kapsüllenmiş dopaminin% 74.8'inin ilk sekiz saat içinde eksozomlardan salındığını ortaya koydu.
Fibroblastlar üzerindeki dopamin yüklü ve serbest eksozomların sitotoksisitesi araştırıldı. Dopamin yüklü eksozomlar herhangi bir sitotoksik etki göstermese de, saponin fibroblast canlılığını azalttı. MTT testi, fibroblastlar dopamin yüklü eksozomlarla tedavi edildiğinde hücre canlılığının arttığını gösterdi.
Sonuçların istatistiksel anlamlılığı tek yönlü varyans analizi yapılarak değerlendirildi. Ek olarak, farklı konsantrasyonlarda serbest eksozomların fibroblastlar üzerindeki sitotoksik etkileri araştırıldı. Fibroblast canlılığı, mililitre başına 25 mikrolitre konsantrasyonda serbest eksozomlarla daha yüksekti.
Merkezi sinir sistemi için hasta boyutları, plastisite, nöro yanıt, yan yana iletişim ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde rol oynaması gerçekten önemlidir. Buna ek olarak, eksozomların yüzeyi sayesinde, hedef hücre ilacı ile etkileşime girebildikleri ve ilaç sırasında verilen aktivitenin tamamlandığı gözlemlenmiştir. Çalışmada ilk kez, dopamini kök hücre kaynaklı eksozomlara kapsülleyerek yeni bir ilaç formülasyonu geliştirdik.
Bu formülasyonun Parkinson hastalığının tedavisi için çok umut verici olacağını öne sürdü.
