Bu çalışma NIH R03 NS087322-01 tarafından Dong, X&#39;e desteklenmiştir.

NOT: Bütün prosedürlere dahil edilen hayvan çalışmaları Kuzey Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. NGF HDL&#39;yi taklit eden nanoparçacıkların hazırlanması <ol><li> 1 mg / mL&#39;de stok solüsyonları hazırlamak için etanol içinde yardımcı maddeler olan fosfatidilkolin (PC), sfingomiyelin (SM), fosfatidilserin (PS), kolesteril oleat (CO) ve D-α-tokoferil polietilen glikol süksinat (TPGS) çözündürülür. NOT: Stok çözeltileri aliquoted ve -20 ° C&#39;de saklanır. Kolesteril oleat koyu renk şişelerde saklandı. PC, SM, PS ve CO stok çözeltileri -20 ° C&#39;de sırasıyla 6, 3, 12 ve 12 ay boyunca sabit kalmıştır. TPGS çözeltisi -20 ° C&#39;de en az 12 ay boyunca stabildi. </li><li> 1.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL protamin USP (suda 1 mg / mL) ile NGF (su içerisinde 1 mg / mL) 10 μL karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Kompleksi oluştur. NOT: NGF ve protamin stok solüsyonları aliquoted edildi ve -20 ° C&#39;de saklandı. NGF stokları için tekrarlanan donma ve çözme önerilmez. </li><li> Bir cam flakona 59 μL PC, 11 μL SM, 4 μL PS, 15 μL CO ve 45 μL TPGS ekleyin. Etanolü yaklaşık 5 dakika nazik azot akımı altında karıştırın ve buharlaştırın; Tüm eksipiyanlar, cam flakonun alt kısmında yağlı, ince bir film oluşturmalıdır. </li><li> Şişeye 1 mL ultrapure (tip 1) su ekleyin ve prototip NP&#39;leri oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika 9,500 rpm&#39;de (8,600 xg) homojenize edin. </li><li> Adım 1.2&#39;de hazırlanan kompleksi prototip NP&#39;lere ekleyin ve cam flakon içerisinde küçük bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırarak 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. <ol><li> NP&#39;leri 30 dakika daha oda sıcaklığında karıştırarak soğutun. Bu soğumadan sonra, 106 uL Apo AI (1.49 mg / mL) ilave edin ve gece boyunca oda sıcaklığında karıştırarak nihaiNGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;ler. </li></ol></li></ol> 2. NGF HDL-taklit eden Nanopartiküllerin Karakterizasyonu <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir parçacık analizcisi kullanarak parçacık boyutunu ve zeta potansiyelini ölçün (Malzeme Tablosuna bakın). </li><li> NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerden boşaltılan NGF&#39;yi ayırmak ve NGF&#39;nin tuzaklanma verimliliğini belirlemek için çapraz bağlı bir agaroz jel filtrasyon kromatografısi sütunu kullanın. <ol><li> Kolon hazırlığı için, 15 mL Sepharose 4B-CL süspansiyonunu 50 mL&#39;lik bir behere aktarın. Boncuk süspansiyonunu bir cam çubuk yardımıyla karıştırın ve bazılarını bir sütuna (30 cm uzunluğunda × 1 cm çapında, alt kısmında cam frit ile birlikte) boşaltıp içine dökün. Kabarcıklardan kurtulmak için hafifçe dokunun. Çözücünün boşaltılmasına ve boncukların birkaç dakika çökelmesine izin verin. </li><li> Kalan süspansiyonu ilave etmeye devam edin. Boncukları temizlemek için kolonun iç cidarını durulayın. Solventi, solvent seviyesi hafifçeDurağan fazın üstünü kaldırın. Kolonu 20 mL 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4 ve 2 mM KH2PO4 içeren) ile yıkayıp kondüsyonlayın. </li><li> Boşalan NGF içeren fraksiyonları belirlemek için, jel filtrasyon sütununa (25 cm uzunluk x 1 cm çap) 200 μL NGF solüsyonu (10 μg / mL) yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. </li><li> Toplam 12 fraksiyon (her fraksiyon için 1 mL) toplayın ve NGF için bir Sandwich ELISA kiti kullanarak her bir fraksiyonda NGF konsantrasyonunu ölçün. </li><li> Sandwich ELISA kiti kullanılarak 6 ila 10 fraksiyonlarından NGF&#39;yi tespit edin. Sütun üzerine boşaltılan NGF&#39;nin bir kromatogramı elde edin. Kolonu 20 mL PBS ile yıkayın. </li><li> NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri içeren fraksiyonları belirlemek için kolona 200 uL NP yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. Toplam 12 fraksiyon toplamak (her fraksiyon için 1 mL) ve her fraksiyondaki partiküllerin yoğunluğunu ölçün uParçacık boyutu analizörünü söyle. NGF NP&#39;lerini fraksiyonlar 2-4&#39;ten tespit edin. NOT: Yoğunluk, test çözeltisinde kaç nanopartikül bulunabileceğini belirten parçacık analizcisi tarafından ölçülen bir parametredir. Çözümde ne kadar çok NP var ise yoğunluk o kadar yüksek olur. Bu yaklaşımla, sütunun NGF NP&#39;lerini boşaltılan NGF&#39;den ayırt edebildiğini doğrulayabiliriz. </li><li> NGF&#39;nin tuzaklanma verimliliğini ölçmek için 200 μL NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri kolona yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. Toplam 12 fraksiyon toplamak (her fraksiyon için 1 mL). </li><li> Sandwich ELISA kiti kullanılarak 6&#39;dan 10&#39;a kadar olan fraksiyonlardan boşaltılan NGF konsantrasyonunu ölçün. </li><li> Boşaltılan NGF olarak 6 ila 10 fraksiyonlarından ölçülen NGF miktarlarını ekleyin ve aşağıdaki denklem kullanılarak NGF&#39;nin yakalama verimliliğini hesaplayın. % EE = (1 - boşaltılan NGF / NP&#39;ye eklenen toplam NGF) x% 100 Denklem (1) </li></ol></li></ol> 3. In vitro NGF HDL salınımıKötüye Kullanan Nanopartiküller <ol><li> Serbest NGF (su içerisinde 10 μg / mL; n = 4) ve NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri (10 μg / mL; n = 4) paralel çalışın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uyarak 8 diyaliz borusunu (molekül ağırlığı kesilmesi: 300 kDa) önceden muamele edin. </li><li> Serbest bırakma ortamı olarak PBS&#39;de% 5 bovin serum albümini (BSA) hazırlayın. 50 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne 30 mL serbest bırakma ortamı ekleyin ve 135 rpm&#39;de çalkalama hızı olan bir çalkalayıcıda 37 ° C&#39;ye kadar ısıtın. Değiştirilmek üzere çalkalayıcıya başka bir 50 mL boşaltma ortamı yerleştirin. </li><li> Diyaliz tüpüne 400 μL serbest bırakma ortamı ekleyin ve diyaliz için yeterli hacim elde etmek için hızlıca 200 μL test numunesini ekleyin. </li><li> Tüpü kapatın ve diyaliz borusunu serbest bırakma ortamına (santrifüj tüpü) hızlıca yerleştirin. Zaman 0 için numune olarak dış diyaliz borusundan 100 uL serbest bırakma ortamını hızla geri çekin. Sonradan analiz için numuneyi -20 ° C&#39;ye derhal koyun. 100 μL taze reGeri alınan numunenin yerini almak için orta santrifüj tüpüne koyun. Zamanlayıcıyı çalıştır. </li><li> 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 ve 72 saatte, 100 uL serbest bırakma ortamını geri çekin ve 100 uL taze ortam ile değiştirin. Geri alınan örnekleri derhal analiz için -20 ° C&#39;ye getirin. </li><li> 72 saat sonra, tüm numuneleri -20 ° C&#39;den çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Salınım numunelerinin NGF konsantrasyonlarını Sandwich ELISA kiti kullanarak ölçün. </li></ol> 4. NGF HDL-taklit eden Nanopartiküllerin Biyoaktivitesi (Nörit Gelişme Çalışması) <ol><li> % 10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu,% 5 sığır fetüsü serumu, 100 ug / mL streptomisin ve 100 ünite / mL penisilin ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında PC12 hücreleri kültür. 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ile nemli bir kuluçka hücresinde hücreleri muhafaza edin. </li><li> Hücreler ~% 70-80 konfluansa ulaştığında, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın (yaklaşık 10 mL /Sup&gt; 2 kültür yüzey alanı). Yıkama çözeltisini çıkarın. Şişeye% 0.25 Trypsin-EDTA solüsyonu (0.25% tripsin ve 1 mM EDTA; 0.5 mL / 10 cm 2 kültür yüzeyi alanı) ilave ederek hücreleri Trypsinize edin ve çoğu hücre ayrılıncaya kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kültür ortamı iki hacim ekleyin ve 180 xg&#39;de 5 dakika aşağı doğru döndürün. Süpernatantı çıkarın ve hücre topağını 5 mL kültür ortamında tekrar süspanse edin. Hücre kümelerini kırmak için hücreleri 22 G, ½ inç iğne ile filtreleyin. </li><li> Hücreleri yeni bir hücre kültürü şişesi içine 1: 3 oranında bölün. Gecelik inkübe edildikten sonra, bağlanmamış PC12 hücrelerini çıkarın. Ekteki hücrelerin daha fazla büyüme için kalmasına izin verin. </li><li> Güçlü bir yapışma özelliğine sahip PC12&#39;nin altkültürünü seçmek için bu prosedürü 3 pasaj için tekrarlayın. 800 μL / kuyucuk sıçan kuyruğu kolajeni tip I (100 μg / mL) ile 6 oyuklu bir plakayı önceden kaplayın. </li><li> Seçilen PC12 hücrelerini aşama 4.2&#39;de açıklandığı gibi deneyin ve bunları birHücre kümelerini kırmak için 22 G, ½ inç iğne. Hemocytometer ile hücreleri sayın. Hücreleri, plakaya yapışmalarına izin vermek için adım 4.5&#39;te önceden kaplanmış 6 oyuklu plakada gece boyunca 10.000 hücre / oyuk yoğunluğunda tohumlandı. </li><li> 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 ng / mL konsantrasyonlarını hazırlamak için kültür ortamı (adım 4.1&#39;de açıklandığı şekilde) ile serbest NGF (10 ug / mL) ve NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri (10 ug / mL) seyreltin. Her oyuktan 2 mL ortam çıkarın ve sulandırılmış serbest NGF veya NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin 2 mL&#39;si ile değiştirin. Kültür 4 gün boyunca. </li><li> 4. günde, ortamı uygun tedaviyi içeren taze ortama (adım 4.1&#39;de açıklanmıştır) değiştirin ve tedaviyi 3 gün daha devam ettirin. </li><li> 7. günde hücreleri ters ışık mikroskopu ile görselleştirin ve her birinin 10X büyütme altında rasgele noktalar halinde görüntüsünü alın. </li></ol> 5. NGF HDL&#39;yi taklit eden nanoparçacıkların biyolojik dağılımı <ol><li> Yetişkin BALB / c farelerini (erkek, 25-30 g) to tNGF NP&#39;lerin doku dağılımı. Fareler, grup başına 3 fareden oluşan üç gruba rasgele bölünürler. Vazodilatasyon ve damarın görünürlüğünü desteklemek için bir fareyi kısıtlamak ve kuyrukluğunu etanol ile silmek için koni şekilli bir plastik tutucu ( örn. Dekapikon) kullanın. </li><li> Her bir fareye (3 grup) 100 μL salin, serbest NGF veya NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri 40 μg / kg NGF dozunda kuyruk damarları yoluyla enjekte edin. 1 mL&#39;lik şırıngaya bağlı 30½ G&#39;lik bir iğne kullanın. </li><li> Enjeksiyondan 30 dakika sonra,% 3 inhale izofluran (2 L / dakika akış oranında oksijen) kullanarak farelere anestezi uygulayın. Anestezi derinliğini belirlemek için bir kuyruk ve ayak parmakları tutturun. Kalp ponksiyonuyla kan toplayın. <ol><li> Kalpten yaklaşık 1 mL kan alın. Her fareyi servikal çıkıkla euthanize edin. </li></ol></li><li> Fare karkasını sırt sırta oturtun. Karnınızı cerrahi makas kullanarak açın ve yağ ve bağırsağı kenara çekin.Karaciğer, dalak ve böbrekleri açığa vurmak için pamuklu çubuk kullanarak. Bu dokuları hasat edin ve kanı temizlemek için 1x PBS içinde durulayın. </li><li> Plazmayı elde etmek için hemen kan örneklerini 3,400 xg&#39;de ve 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. Analizler oluncaya kadar plazmayı ve dokuları -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Doku örneklerini analiz etmek için, numuneleri -80 ° C&#39;den 4 ° C&#39;ye hareket ettirin ve 100 mg doku örneğini 10x hacimlik bir ekstraksiyon tamponunda (0.05 M sodyum asetat, 1.0 M sodyum klorür,% 1 triton X-100, % 1 BSA, 0.2 mM fenilmetansülfonil fluorür ve 0.2 mM benzetonyum klorid) ile yıkandı. 10,000 rpm&#39;de ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca homojenize edin. </li><li> Adım 5.3 ve 5.4&#39;te açıklandığı gibi boş plazma ve dokuları toplamak için iki muamele edilmemiş fareyi kurban edin. Boş plazma veya boş doku homojenatları kullanarak NGF standart solüsyonları hazırlayın. </li><li> Plazma ve doku homojenatlarındaki NGF konsantrasyonlarını yukarıda tarif edildiği gibi Sandwich ELISA kiti kullanarak belirleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+and+recent+advances+in+peptide+and+protein+drug+delivery.">Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery.</a> Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).</li><li>Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+lipoprotein-mediated+drug+delivery+system.">A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).</li><li>Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+as+a+drug+and+nucleic+acid+delivery+vehicle.">HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle.</a> Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).</li><li>Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+delivery+of+protein+therapeutics.">Long-term delivery of protein therapeutics.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).</li><li>Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medical application of liposomes. , (1998).</li><li>Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+an+update+review.">Liposomal drug delivery systems: an update review.</a> Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).</li><li>Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspheres+for+protein+delivery+prepared+from+amphiphilic+multiblock+copolymers:+2.+Modulation+of+release+rate.">Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate.</a> J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).</li><li>Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+protein+and+peptide+drug+delivery:+a+special+emphasis+on+polymeric+nanoparticles.">Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles.</a> Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).</li><li>Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoproteins:+nature's+multifunctional+nanoparticles.">High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles.</a> ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).</li><li>Gursky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+and+functional+remodeling+of+high-density+lipoproteins.">Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).</li><li>McMahon, K. M., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoproteins+for+the+systemic+delivery+of+short+interfering+RNA.">High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA.</a> Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).</li><li>McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+as+cancer+therapy.">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy.</a> Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).</li><li>Lerch, P. G., F&#246;rtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+a+reconstituted+high+density+lipoprotein+for+therapeutic+applications.">Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications.</a> Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).</li><li>Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mimicking+peptide-lipid+nanoparticles+with+improved+tumor+targeting.">HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting.</a> Small. 6 (3), 430-437 (2010).</li><li>Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+step+reconstitution+of+multifunctional+high-density+lipoprotein-derived+nanomaterials+using+microfluidics.">Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics.</a> ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).</li><li>Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+HDL-mimicking+&#945;-tocopherol-coated+nanoparticles+to+encapsulate+nerve+growth+factor+and+evaluation+of+biodistribution.">Development of novel HDL-mimicking &#945;-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution.</a> Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada, NGF kapsüllemesi için HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri hazırlamak için basit bir yöntem gösteriyoruz. Proteinleri vermek için çeşitli NP dağıtım sistemleri incelenmiştir. Günümüzde birçok NP preparatı diyaliz, çözücü çöktürme ve film hidrasyonunu içermektedir. Bu işlemler genellikle karmaşıktır ve büyütme konusunda zorlayıcıdır. Bu NP gelişiminde, lipidlerin konteynırın cam duvarı ile kuvvetli yapışması olduğu ve bunun ince filmin hidratasyonunda ve katkı ma...

Proteinler, peptitler ve nükleik asitler gibi makromoleküller umut verici ilaçlar olarak ortaya çıkmakta ve son on yılda 1 , 2 önemli derecede ilgi görmüştür. Yüksek etkililiği ve spesifik hareket modları nedeniyle, kanser, bağışıklık sistemi hastalıkları, HIV ve ilgili koşullar 3 , 4&#39;ün tedavileri için mükemmel tedavi potansiyeline sahiptirler. Bununla birlikte, büyük molekül boyutu, üç boyutlu yapı, yüzey yükleri ve hidrofilik doğa gibi fizyokimyasal özellikler, bu makromoleküllerin in vivo dağıtılmasını zorlaştırmaktadır. Bu onların klinik kullanımını önemli ölçüde engeller 4 . Mikropartiküller, polimer nanopartikülleri (NP), lipozomlar ve lipid NP&#39;leri gibi ilaç dağıtım sistemlerinde son zamanlarda kaydedilen ilerlemeler, bu güçlükleri aştı ve makro moleküllerin in vivo teslimatını önemli ölçüde geliştirdi. HoDüşük ilaç yükleme kapasitesi, düşük tuzaklanma verimi, kısa yarılanma ömrü, biyoaktivite kaybı ve istenmeyen yan etkiler de dahil olmak üzere, bu teslim kargolarıyla ilgili bazı dezavantajlar ortaya çıkmıştır 5 , 6 , 7 , 8 . Etkili taşıyıcı sistemler, araştırma konusu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, uyuşturucu yüklü NP&#39;leri karakterize etmek için analitik yöntemlerin geliştirilmesi makromoleküller için küçük moleküllerden ziyade daha zorlayıcıdır. Yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), apolipoproteinler ve bir fosfolipid tek tabaka tarafından kaplanan bir lipid çekirdeğinden oluşan doğal bir NP&#39;dir. Endojen HDL, SR-BI, ABCAI ve ABCG1 gibi hedef reseptörlerle etkileşimi yoluyla lipidlerin, proteinlerin ve nükleik asitlerin taşınmasında kritik bir rol oynamaktadır. Farklı terapötik ajanların verilmesi için bir araç olarak araştırılmıştır 9, 10 , 11 , 12 . HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Diyaliz, popüler bir yaklaşımdır. Bu yöntemde, NPs, bir lipid filmi sodyum klorür çözeltisi kullanarak hidratlayarak oluşturulur. Tuz 3 saatlik tamponlarla 2 günlük bir diyaliz vasıtasıyla uzaklaştırılır. Sonikasyon yöntemleri, lipid karışımını ısıtma koşullarında 60 dakika sonikleştirerek NP&#39;leri üretir; NP&#39;ler jel kromatografisiyle ( 14) daha da arıtılır. Mikroakışkanlar, odaklanma modelinde mikrovorteks yaratarak fosfolipidleri ve apolipoprotein AI (Apo AI) solüsyonlarını karıştıran bir mikroakışkan cihaz aracılığıyla NP üretir. Açıkçası, bu yöntemler, endüstriyel ölçeklendirme için zaman alıcı, sert ve zor olabilir. Bu yazıda, sinir için yeni HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin hazırlanması ve karakterize edilmesiBüyüme faktörü (NGF) kapsülleme. NGF, iki 13.6-kDa polipeptid monomeri ihtiva eden bir disülfid bağlı polipeptid homodimeridir. NP&#39;leri homojenizasyon ile hazırlamaya yönelik yenilikçi bir prosedür, ardından NP&#39;ler içine NGF&#39;nin kapsüllenmesi geliştirildi. NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;ler parçacık boyutu, boyut dağılımı, zeta potansiyeli ve in vitro salım için karakterize edildi. Biyolojik aktiviteleri, PC12 hücrelerinde nörit büyümesi için değerlendirildi. NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin biyolojik dağılımı, farelerde intravenöz enjeksiyondan sonra serbest NGF&#39;nin biyolojik dağılımı ile karşılaştırıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Beta-NGF</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>NGF-05H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-a-Phosphatidylcholine (PC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>131601P</td>
			<td>95%, Egg, Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (SM)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Brain, Porcine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine (PS)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840032P</td>
			<td>Brain, Porcine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl oleate (CO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-&#945;-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)</td>
			<td>BASF</td>
			<td>9002-96-4</td>
			<td>Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>meets USP testing specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apolipoprotein A1, Human plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology</td>
			<td>16-16-120101</td>
			<td>1mg in 671 &#181;l 10 mM NH4HCO3, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 4B-CL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CL4B200</td>
			<td>Cross-linked agarose,&#160; gel filtration chromatography column filling material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich ELISA Kit for NGF</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>DY008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30074.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzethonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Tekmar</td>
			<td>T 25-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delsa Nano HC particle analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Delsa Nano HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>G235036</td>
			<td>Molecule Cutoff 300 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytron homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT 1200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DecapiCone</td>
			<td>&#160;Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>DC-M200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation

Bu makalenin amacı, sinir büyüme faktörü (NGF) yüklü, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) -impek nanopartiküller (NP) için hazırlama ve karakterizasyon yöntemlerini tanıtmaktır. HDL&#39;ler endojen NP&#39;lerdir ve terapötik ajanlar verilmesi için araçlar olarak araştırılmıştır. HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, genellikle karmaşıktır, zaman alıcıdır ve endüstriyel ölçeklendirme için zorlanmaktadır. Bu çalışmada, yardımcı maddeleri karıştırmak ve prototip NP&#39;ler oluşturmak için bir adımlı homojenleştirme kullanılmıştır. NGF, 26 kDa&#39;lık suda çözünür bir proteindir. NGF&#39;nin HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin lipid ortamına kapsüllenmesini kolaylaştırmak için protamin USP, NGF yüzeyindeki yükleri nötralize etmek için NGF ile bir iyon-çift kompleksi oluşturmak için kullanıldı. Daha sonra NGF / protamin kompleksi, prototip NP&#39;lere sokuldu. Apolipoprotein AI nihayet NP yüzeyinde kaplandı. NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;ler terimde tercih edilen özellikleri gösterdiBoyut dağılımı, tuzaklanma verimi, in vitro serbest bırakma, biyo-aktivite ve biyo-dağılım. HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerde dikkatli bir tasarım ve homojenleştirme araştırması ile prosedürü büyük ölçüde basitleştirildi ve NP&#39;ler ölçeklenebilir hale getirildi. Üstelik boşaltılan NGF&#39;nin NP&#39;lerden ayrılması, güvenilir in vitro salınım çalışmaları yapılması ve NP&#39;lerin biyoaktivitesinin ölçülmesi gibi çeşitli zorluklar aşılmıştır.

Bir iyon çift stratejisi ile hazırlanan, HDL&#39;yi taklit eden α-tokoferol kaplı NGF NP&#39;lerin mühendislik şeması Şekil 1&#39;de gösterilmektedir. NGF&#39;nin yüzey yüklerini nötralize etmek için, protamin USP, NGF ile bir kompleks oluşturmak için bir iyon çift ajan olarak kullanılmıştır. Biyoaktiviteyi korumak için HDL&#39;yi taklit eden prototip NP&#39;ler ilk önce homojenleştirme kullanılarak üretildi; Daha sonra, NGF / protamin kompleksi,...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation at JoVE.com

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Basit homojenizasyon, sinir büyüme faktörünü kapsüllemek için yeni, yüksek yoğunluklu, lipoprotein-taklit nanoparçacıklar hazırlamak için kullanıldı. Bu makalede, nanoparçacık hazırlığı, in vitro karakterizasyon ve in vivo çalışmalar için zorluklar, ayrıntılı protokoller anlatılmıştır.

Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL&#39;yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

preparation-characterization-novel-hdl-mimicking-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Görüntüleme.  University of North Texas Health Science Center.  Basit homojenizasyon, sinir büyüme faktörünü kapsüllemek için yeni, yüksek yoğunluklu, lipoprotein-taklit nanoparçacıklar hazırlamak için kullanıldı. Bu makalede, nanoparçacık hazırlığı, in vitro karakterizasyon ve in vivo çalışmalar için zorluklar, ayrıntılı protokoller anlatılmıştır. 

Video: Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Biyomühendislik

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Bir Roman Vokal Fold Bioreactor İnşaatı ve Karakterizasyonu

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

A protocol for the preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug loaded 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG) micelles is described.

Lipofilik Doksorubisin Pro-ilaç misellerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Gözenekli silisyum filmleri sinir büyüme faktörü taşıyıcı olarak tasarlama

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...