Bu protokol, kullanıcının fare retinal görüntülemesinde klinik olarak benzer hasar belirteçlerini nicel olarak ölçmesine olanak tanır ve bu da sonraki bulguların çevrilebilirliğini destekler. Bu yöntemler, analizi kolaylaştırmamıza ve deney hayvanları arasındaki görüntülemeyi güvenilir bir şekilde karşılaştırma yeteneği vermemize olanak tanır. Bu yöntemler bir fare modeline genel bakışı incelemek için geliştirilmiş olsa da, aynı görüntüleme tekniklerini kullanan herhangi bir retina hastalığı üzerine yapılan araştırmalara kolayca uzanabilirler.
Retinal görüntüleme mikroskobu ışık kutusunu, optik koherens tomografi makinesini ve ısıtılmış fare platformunu açın. Bilgisayarı açın ve görüntüleme programını açın. Her göze bir damla fenilefrin ve tropikamidin ekleyin.
100 mikrolitre% 1 floresein intraperitoneal enjekte edin. Fareyi platforma yerleştirin. Retinal fundusun görünümü net ve odaklanmış olana kadar platformun yüksekliğini ve açısını ayarlayın.
Fundusun fotoğrafını çekin. Görüntüleme ve optik koherens tomografi yazılımını açın. Optik koherens tomografi programında dürtmeyi 10'a ayarlayın.
Optik koherens tomografi görüntüsü alın, yanıktan 75 mikrometre distal ekleyin. Retinanın diğer üç kadranını tekrarlayın. Fotoğraf makinesini 488 nanometre filtreye geçirin.
Kamera kazancını 5'e yükseltin. Floresein enjeksiyonundan tam 5 dakika sonra fundusun fotoğrafını çekin. Görüntü işleme yazılımında floresein görüntüsünü açın.
Görüntüyü çoğaltın. Bir seçim aracı kullanarak, ana gemileri dikkatlice izleyin. Bu gemilerden dallanan gemileri görmezden gelin.
İlk görüntüde, yalnızca gemiyi bırakarak seçimi silin. Bu maskelenmiş görüntüyü kaydedin. Seçimi ikinci görüntüye taşıyın, seçimi tersine çevirin ve arka planı yalıtarak silin.
Bu maskelenmiş görüntüyü kaydedin. Arka plan görüntüsünü açın ve entegre yoğunluğu ölçün. Gemiler görüntüsünü açın, gemilerin ana hatlarını seçin ve ardından ortalama yoğunluğu ölçün.
Arka planın entegre yoğunluğunu damarların ortalama yoğunluğuna bölün ve göz için sızıntı oranını oluşturun. Her göz için bu sızıntı oranını deneysel bir kohortta kaydedin. Arka plan için daha fazla kontrol sağlamak için, deneysel gözleri yaralanmamış kontrol gözlerinin ortalama sızıntı oranına normalleştirin.
Görüntü işleme yazılımında optik koherens tomografi görüntüsünü açın. Ganglion hücre tabakasının, iç pleksiform tabakanın, iç nükleer tabakanın, dış pleksiform tabakanın, fotoreseptör tabakasının ve RPE tabakasının sınırlarını izleyin. Dosyaları CSV olarak dışa aktarın.
Her katmanın ortalama kalınlığını ölçün ve deney kohortundaki her göz için tekrarlayın. Optik koherens tomografi görüntüsünü J görüntüsünde açın.Çizgi aracını kullanarak, dış pleksiform tabakanın üst sınırının belirsiz olduğu mesafeyi ölçün. Dağınıklığın başladığı enlemi koruyarak yatay olarak ölçün.
Görüntüdeki düzensiz mesafelerin toplamını hesaplayın. Düzensizlik oranını elde etmek için düzensizlik uzunluğunu retinanın toplam uzunluğuna bölün. Retinanın diğer üç kadranından optik koherens tomografi görüntüleri için ölçüm ve hesaplamayı tekrarlayın.
Dört optik koherens tomografi görüntüsünden düzensizlik oranlarının ortalamasını alın. Bu sayı, tüm retina için ortalama düzensizliği temsil eder. Deneysel kohorttaki her göz için tekrarlayın.
Her retina görüntüsü için sızıntı oranının hesaplanmasında kullanılan maskeli görüntüler diğerleriyle karşılaştırılabilir ve analiz edilerek majör vaskülatürü retinanın diğer bölgelerinden ayırılabilir. Floresein miktarı, yaralanma şiddeti ve tedavi etkinliğinin karşılaştırılmasına ve yaralanma süresi boyunca sızıntıdaki değişikliklerin incelenmesine olanak tanır. OCT görüntüsünde retina katmanlarının bir tasviri gözlenir.
Her retina tabakası için kalınlığın ölçülmesi, başlangıçtaki ödemli yanıtın iç retina tabakaları üzerinde daha derin bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Retinal ven tıkanıklığı hasarının bir zaman seyrinin analizinden, retina tabakalarının ilk enflamatuar şişmesi ve nihai dejeneratif incelme gözlenebilir. İç nükleer tabaka ilk yaralanmaya çok daha büyük bir tepki verir, ancak iç pleksiform tabaka, ilk ödem stabilize edildikten ve taban çizgisine döndükten sonra daha şiddetli incelme gösterir.
İç retina tabakasının dağınıklığı, dış pleksiform tabakanın üst sınırının kaybolması, dış pleksiform ve iç nükleer tabakaların bir araya gelmesi olarak kendini gösterir. İki deney grubunun retinal disorganizasyonu, retina hasarını hafifletmede bir inhibitörün etkinliğini araştırmak için karşılaştırıldı. Görüntü kalitesi, analiz kalitesi için hayati öneme sahiptir.
Retinal görüntüler elde ederken, fundus ve retina tabakalarının mümkün olduğunca net ve odaklanmış olduğundan emin olmak için zaman ayırın. Bu non-invaziv yöntemler, hastalığın daha çok yönlü ve ayrıntılı profillerini oluşturmak için uzunlamasına ve dokunun biyokimyasal ve immünohistokimyasal çalışması ile birlikte kullanılabilir. Bu teknik, nörovasküler hastalık modellerinde in Vivo retinal görüntüleme verilerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar, böylece veriler insan hastalığına daha kolay çevrilebilir.
