Protokol, vasküler yaralanma mekanizmalarını ve müteakip ödem gelişimini non-invaziv bir şekilde araştırmak için bir model sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, cerrahi müdahale olmadan yaralanmayı zaman içinde canlı olarak takip edebilmenizdir. Bu, tedavileri daha verimli bir şekilde test etmek için yollar sağlar.
Uygun kuyruk damarının nasıl yapılacağını ve hayvanın platforma doğru şekilde yerleştirilmesini öğrenmek zor olabilir. Her iki teknik için de sabırlı olmanızı ve işleri ağırdan almanızı öneririm. Başlamak için, fiber optik kabloyu yavaşça tutun ve lazer kontrol kutusuna ve retinal görüntüleme mikroskobunun lazer adaptörüne bağlayın, ardından retinal görüntüleme mikroskobu lamba kutusunu açın.
Bilgisayarı açın ve görüntüleme programını açın. Mikroskop göz merceğinin önüne bir parça beyaz kağıt yerleştirin ve görüntüleme programında Ayarla'ya tıklayarak beyaz dengesini ayarlayın. Anahtarı çevirerek ve lazer kontrol kutusunun ekranındaki talimatları izleyerek lazer kontrol kutusunu açın.
Temel lazer gücünü doğrulamak için, lazer kontrol kutusunu 50 miliwatt ve 2.000 milisaniyeye ayarlayın. Ardından lazeri açın ve güç ölçeri göz merceğinin önüne yerleştirin. Lazeri etkinleştirmek için ayak anahtarı pedalına basın ve lazer güç okumasının 13 ila 15 miliwatt olmasını hedefleyin.
Ardından, lazer kontrol kutusu ekranını kullanarak, deneysel lazer gücünü 100 miliwatt ve 1.000 milisaniyeye ayarlayın ve lazeri kapatın. 500 mililitrelik bir beherin içine 300 mililitre su dökün ve beheri mikrodalga fırında bir dakika ısıtın. Sonra ılık suya bir gazlı bez yerleştirin.
Daha sonra iki aylık bir erkek fareyi bir tutucuya yerleştirin. Sıcak gazlı bezi yavaşça fare kuyruğuna bastırın ve genişlemiş damarları arayın. 26 gauge'lik bir iğne kullanarak, hayvanın ağırlığına göre uygun miktarda gül bengal enjekte edin ve bölgeyi silmeden önce hematom veya kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.
Ardından fareyi tutucudan serbest bırakın ve kafese geri koyun. Gül bengalinin anestezik enjeksiyonundan önce dolaşması için sekiz dakika bekleyin. Isıtmalı fare platformunu açın.
Daha sonra farenin her gözüne bir damla fenilefrin ve tropikadit ekleyin. Anesteziyi onayladıktan sonra, göz başına bir damla proparakain hidroklorür ekleyin, ardından her iki göze de göz merhemi ekleyin. Daha sonra, kulakların arasına deri altından 150 mikrolitre karprofen enjekte edin.
Ardından fareyi platforma yerleştirin ve retinal fundusun görünümü net ve odaklanmış olana kadar platformu ayarlayın. Retina damarlarını sayın ve fundusun görüntüsünü alın. Ardından, lazeri açın ve optik diskten yaklaşık 375 mikrometre uzakta bir retina damarına doğru hedefleyin.
Ayak anahtarına basarak ve lazer ışınını 100 mikrometreye kadar hafifçe hareket ettirerek kabı ışınlayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın ve her darbeden sonra lazer ışınını hareket ettirin, böylece ışınlama tek bir noktaya odaklanmaz. İki ila üç tıkanıklık elde etmek için ışınlamayı diğer büyük damarlarda tekrarlayın.
Kapları ışınladıktan sonra, lambayı kapatın ve 10 dakika bekleyin. Sonra lambayı tekrar açın, tıkanmış damarların sayısını sayın ve fundusun bir görüntüsünü alın. Görüntü alma ve salin enjeksiyonundan sonra, her iki göze de kayganlaştırıcı göz damlası ve jel merhem ekleyin.
Fareyi anesteziden kurtulurken izleyin ve yalnızca tamamen iyileştiğinde diğer hayvanlarla kafese geri gönderin. Lazer ışınlamasından hemen sonra elde edilen tıkanıklık sayısı, gül bengal uygulamasından 10 ila 20 dakika sonra lazerlenen hayvanlar arasında farklı değildi. Retinal ven tıkanıklığından bir gün sonrasına kadar devam eden tıkanıklık sayısı, genotipten bağımsız olarak gül bengal uygulamasından 20 dakika sonra lazerlenen hayvanlarda anlamlı olarak azalmıştır.
100 miliwatt'lık deneysel gücü değiştirmeden, 11.5 miliwatt'lık düşük bir temel lazer gücü, tıkanmalara neden olmadı. Buna karşılık, 13.5 miliwatt'lık bir temel lazer çıkışı başarılı tıkanmalarla sonuçlandı. Lazer fotokoagülasyondan sonra dört ana tıkanıklık türü ortaya çıkar: tamamen tıkanmış damarlar, kısmen tıkalı damarlar, kısmen reperfüze edilmiş ve tamamen reperfüze edilmiş damarlar.
Tamoksifen ile indüklenebilen endotel hücreli Casp9 nakavt farelerinin ışınlanmış vaskülatürü, kısmen reperfüze edilmiş ve kısmen tıkanmış durumlarda, tamamen tıkanmış durumlarda daha fazla zaman harcayan C57 Black 6 farelerinkinden daha fazla zaman harcadı. Lazer fotokoagülasyondan sonraki ilk 10 dakika içinde damarların tıkanma durumu hızla değişir ve yaralanmadan 24 saat sonra alev şeklinde kanamalar gözlenir. Retinal ven tıkanıklığı sonrası farklı oftalmik patolojiler ortaya çıktı.
Retinal ven tıkanıklığı sonrası retinal ödem düzeyi optik koherens tomografi görüntüleri kullanılarak yaralı gözlerde ölçülebilir. Nöronal tabakaların durumu, retinal iç tabakaların dağınıklığını değerlendirerek de belirlenebilir. Her katman için karşılık gelen etiketlerle birlikte optik koherens tomografi görüntüsünün bir örneği burada gösterilmiştir.
Temel lazer gücünün ölçülmesi önemlidir. Bu okuma, oklüzyonların başarısını büyük ölçüde etkileyecektir ve optimize edilebilir. OCT, ERG ve Optiger gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir.
Bu, nörovasküler hasarın retinal nöronal bütünlük ve görsel yol fonksiyonu üzerindeki etkilerinin ele alınmasına yardımcı olacaktır. Bu teknik, nörovasküler hastalığı yönlendiren moleküler yolları sorgulamanın yolunu açar ve zaman içinde bireysel hayvanları takip ederek, insan hastalığına daha kolay çevrilebilecek veriler sağlar.
