PS Retina Hücre Biyolojisi Kanada Araştırma Başkanı ve Alcon Araştırma Enstitüsü Yeni Araştırmacı Ödülü tutar. Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri (221478) hibe tarafından desteklenen, Kanada Diyabet Derneği (OG-3-11-3329-PS), Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi (418.637) ve Vakfı Mücadele Körlük Kanada. Desteği de Reseau de Recherche en Sante de la Vision du Québec tarafından sağlandı.

Etik deyimi: Tüm hayvan deneyleri Görme ve Oftalmoloji oftalmik Hayvanların Kullanımı ve Vizyon Araştırma ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (ARVO) Bildirimi Araştırma Derneği tarafından kurulan hayvan bakım kurallarına uyar. 1.. Oksijen İsteyerek Retinopati (OSB) <ol><li> Tutanak P0 olarak fare yavrularının doğum tarihi. </li><li> Yeterli ağırlık aralığı sağlamak için O 2 girmesiyle tüm hayvanların ağırlıkları kaydedin. Not: P17 da C57BL / 6 fareleri için, vücut ağırlığı maksimum NV 32 boyunca 5 ve 7.5 g arasında olmalıdır. Çevre sağlamak amacıyla, bu (genetik olarak modifiye edilmiş farelerde hem de farenin deneysel tedavi alan) bir kontrol olarak kardeşlerinden kullanılması tavsiye edilir. Bir viral vektör etkilerini değerlendirirken, bir virüsün tropizminin düşünün ve viral-teslim transgenlenn tam ifadesi için yeterli zaman tanımak gerekir. Hızla sentezleyen viralBu tür 3. nesil lentivirüsler 24, 25 olarak vektörler, 33 tavsiye edilir. </li><li> P7 (C57BL / 6 ya da istenilen gerginlik) ve 5 gün 27 için% 75 O 2 set bir oksijen odasına annesini teşvik bir CD1 de yer fare yavrular. Çevresel nem ve sıcaklık O 2 maruz boyunca sabit tutuldu. Not: O 2 merkezi bir kaynağı ile donatılmış Araştırma tesisleri ideal ve boş O 2 tankları hantal değiştirilmesini sınırlamak. Transgenik ya da nakavt fareler çalışma durumunda, bu kontrol ve deney fareler aynı suşlar 30, 29 içinde, genetik akımlarını sınırlamak için, aynı satıcıdan alınan sağlamak için önemlidir. </li><li> P12 olarak, oksijen odasından fareler kaldırmak ve O 2 çevre hayvanlar dönün. </li></ol> İç Retina için Bileşiklerin teslimi için 2. İntravitreal Enjeksiyon (WhFarmakolojik bir bileşik ya da rekombinant protein en Değerlendirme etkileri) <ol><li> P14 noktada oksijen 2 L / dk (veya seçim hayvan koruma komitesi onaylı anestezik)% 2 izofluran ile fareler uyutmak. Anestezi etkinliğini doğrulamak için, sırayla forseps ile kuyruk, arka ayak ve kulak çimdik. </li><li> Karnı üzerinde fare yerleştirin. </li><li> Eğimli bir çekilmiş cam bir iğneye sahip bir şırınga 10 ul steril kullanarak, 45 ° ile, gözün posterior limbus araştırılmaktadır bileşiği veya araç (fizyolojik tuzlu su) ihtiva eden bir çözeltinin 1 ul bir maksimal hacim enjekte gerçekleştirmek Lensi kaçınarak açısı. Not: çekilmiş cam iğneli epoksi reçine bir damla şırınga ile eklenir. </li><li> Farenin gözüne bir bez ile yağ oftalmik merhem (ideal antibiyotik ile) bir damla uygulayın. </li><li> Anneyi teşvik ile geri kafesine fare dönün. Fareler daha sonra dikkatli bir şekilde yeniden kadar izlenirkapalı ve tam olarak ayakta. </li></ol> Flöresein Anjiyografi ile Gemi Perfüzyonunun ve Bariyer Fonksiyonu (Dürüstlük) 3. Değerlendirilmesi <ol><li> Oksijen 2 L / dk (veya seçim hayvan koruma komitesi onaylı anestezik)% 2 izofluran ile fareler anestezi. Anestezi etkinliğini doğrulamak için, sırayla forseps ile kuyruk, arka ayak ve kulak çimdik. Not: yenilenme değerlendirilir, bu tipik olarak P17 gerçekleştirilir. Ayrıca carry-out analizi P19 ve P21 damar bütünlüğü zamanla korunmuş olup olmadığını belirlemek için. </li><li> Bir kez anestezi, fare tartın. </li><li> Diseksiyon makas ile orta hat karın kesi olun. Not: Diseksiyon araçları düzenli olarak kontrol ve bilenmiş olmalıdır. </li><li> Yanal kaburga Kes ve forseps yardımı ile göğüs kafesi yükseltmek. Not: kalbe zarar görmesini önlemek için yanal olarak mümkün kesmek gereklidir. </li><li> Perip uzaklaştırılmasından sonrakalpten Heral doku, hemostatik forseps ile inen aorta kelepçe. </li><li> Yavaş yavaş 25 G iğne kullanılarak sol ventrikül fluoreseini-dekstran enjekte. Not: vasküler bariyer fonksiyonu incelenmiştir ise, 70 kDa floresein-dekstran damar bütünlüğü tehlikeye zaman damarların sızıntı gibi kullanılır. Araştırmacı kan damarlarını döküm istiyorsa, 2 MDa floresein-dekstran kullanılır. Kritik adımlar: 1) homojen bir bölünmeyi, santrifüj fluoreseini-dekstran sağlamak ve yüzer enjekte, 2) damarı daralma önlemek amacıyla, ısıtılmış floresein-dekstran solüsyonu enjekte etmek, 3) Tirajı zaman gerektiği aşırı değil 4 dk. </li><li> İşletim makas ile enjeksiyondan sonra farelere 2 dk başını kesmek. </li></ol> 4.. Enükleasyon ve Göz Fiksasyon Not: vasküler rejenerasyon oranlarını değerlendirirken, ilk P12 olarak ve ayrıca P14 ve P17 ile retina toplamak. Örneklenmiş zaman noktasında sayısını artırınrevaskülarizasyon 24 oranlarının daha doğru belirlenmesi için i. <ol><li> Fare kafasını yatırın ve yan üzerine yerleştirin. </li><li> Cilt ve diseksiyon makas kullanarak göz kapaklarını kaplayan çıkarın. </li><li> Göz altında kavisli bir forseps yerleştirin ve yavaşça optik sinir ayrılana kadar yukarı doğru çekin. </li><li> Onun diğer yüzüne farenin kafasını çevirin ve aynı adımları (4.2 ve 4.3 adımları) gerçekleştirin. </li><li> Fiksatif daha iyi nüfuz etmesini sağlamak için, 30 G iğne ile, gözün anteryor odacığı bir delik delinerek. </li><li> % 4 paraformaldehit (PFA) ihtiva eden bir tüpe aktarın ve gözler, oda sıcaklığında 1 saat boyunca düzeltin. </li><li> PFA çıkarın ve buz gibi soğuk PBS çözeltisi ile gözler 4 kez yıkayın. </li></ol> 5.. Retina Diseksiyon <ol><li> Soğuk PBS içeren bir Petri kabındaki fare gözleri yerleştirin ve bir stereo mikroskop altında retina diseksiyon. </li><li> Mikro diseksiyon bilim ile göz çevresindeki fazla yağ / doku çıkarınssors. </li><li> Mikro diseksiyon makas ile kornea kesti. </li><li> Forseps iki çift kullanarak, inceden uzak optik sinir doğru çevreden sklera soyma ve atın. </li><li> Forseps ile lens (kornea altında beyazımsı top) sıkın ve göz fincan ayıklayın. Bir destek olarak forseps çifti, ve kavrama diğer kullanın ve dikkatli lens yükseltmek ve çıkarın. </li><li> Küçük fırçalar (boyut 0) ve forsepsler kullanılarak retinanın iç taraftan cam gibi damarları ayırın. </li><li> Forseps kullanarak optik diskin bağlı hiyaloid gemilerin demetleri çıkarın. </li><li> Aktarım önce boyama işlemine başlamadan için buz üzerinde PBS ve yeri ihtiva eden 2 ml mikrosantrifüj tüplerine retina kesilir. </li></ol> 6.. Retina Damar Boyama <ol><li> Gece boyunca yumuşak bir floresan PBS içinde bağlanmış-isolectin B4 (rodamin-lektin ya da diğer) 1 mM CaCl2 ihtiva eden bir çözelti içinde, 4 ° C&#39;de çalkalayarak kesilir retina inkübe </sub&gt; (1:100 2 mg / ml isolectin B4 çözümün seyreltme tavsiye edilir). Tüm boyama işlemi sırasında, alüminyum folyo ya da ışıktan korumak için ışık geçirmeyen bir folyo ile tüpleri kapsamaktadır. </li><li> Ertesi gün, boyama çözeltisi çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 3x retina yıkayın. </li></ol> Retinal Flatmounts 7. Hazırlanması <ol><li> Bir mikroskop lamı üzerine, fotoreseptör tarafı aşağı retina, transfer ve dört eşit büyüklükte parçaya bölünür retina bölmek için bir cerrahi neşter kullanılarak dört adet derin eşit radyal kesiler yapmak. Hareket etmez, böylece kesiler sırasında, bir fırça ile retina destekleyin. </li><li> PBS batırılmış iki fırça kullanarak, dikkatli bir kadran fotoreseptör yan aşağı dümdüz ve fotoğraf beyazlatma önlemek için orta montaj retina batırmayın. Sonra dikkatlice basınç uygulayarak ve hava kabarcıkları kapak kayma altında birikir yok emin olmadan monte retina yüzeyinde bir lamel yerleştirin. &lt;/ Li&gt; </ol> 8. Önce 31 Açıklanan Görüntüleme ve Vasoobliteration (VO) ve Neovaskülarizasyonunun (NV) Kantitasyonu olarak <ol><li> 10X bir büyütmede bir epi-floresan mikroskobu ile tam monte edilmiş retina görüntülerini al. </li><li> Fotoğraf düzenleme yazılımı retina görüntü açın, bir araya dikmek ve total retina alanı ve avasküler alanı ölçmek. Konum piksel olarak ifade edilebilir. </li><li> Retinal alanında piksel sayısı ile avasküler alanında piksel sayısına bölünmesi ile VO ölçüde belirler. </li><li> Açıklandığı gibi, 31 total retina alanındaki piksel sayısına göre NV&#39;nin piksel sayısına bölünmesiyle NV kapsamını belirler. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring.">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436, 193-200 (2005).</li><li>Eichmann, A., Thomas, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Parallels+between+Neural+and+Vascular+Development.">Molecular Parallels between Neural and Vascular Development.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).</li><li>Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+vascular+development:+lessons+from+the+nervous+system.">Guidance of vascular development: lessons from the nervous system.</a> Circ Res. 104, 428-441 (2009).</li><li>Stefater Iii, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+angiogenesis+by+a+non-canonical+Wnt-Flt1+pathway+in+myeloid+cells.">Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells.</a> Nature. 474, 511-515 (2011).</li><li>Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+microglia+in+retinal+blood+vessel+formation.">Potential role of microglia in retinal blood vessel formation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).</li><li>Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurovascular+link+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications.">The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Neuron. 71, 406-424 (2011).</li><li>Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+molecular+genetics+and+pathology+of+hereditary+small+vessel+diseases+of+the+brain.">Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).</li><li>Brun, A., Englund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+white+matter+disorder+in+dementia+of+the+Alzheimer+type:+a+pathoanatomical+study.">A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study.</a> Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).</li><li>Prat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multiple+sclerosis+lymphocytes+through+brain+endothelium.">Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium.</a> Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).</li><li>Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gray+matter+perfusion+correlates+with+disease+severity+in+ALS.">Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS.</a> Neurology. 74, 821-827 (2010).</li><li>Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy.">Diabetic retinopathy.</a> N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).</li><li>Hartnett, M. E., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+management+of+retinopathy+of+prematurity.">Mechanisms and management of retinopathy of prematurity.</a> N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).</li><li>Sapieha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinopathy+of+prematurity:+understanding+ischemic+retinal+vasculopathies+at+an+extreme+of+life.">Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life.</a> J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).</li><li>Chen, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinopathy+of+prematurity.">Retinopathy of prematurity.</a> Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).</li><li>Cheung, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy+and+systemic+vascular+complications.">Diabetic retinopathy and systemic vascular complications.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).</li><li>Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+the+eyes+of+a+child:+understanding+retinopathy+through+ROP+the+Friedenwald+lecture.">Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).</li><li>Caballero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+vascular+damage+can+be+repaired+by+healthy,+but+not+diabetic,+endothelial+progenitor+cells.">Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells.</a> Diabetes. 56, 960-967 (2007).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+STAT3+activation+inhibits+retinal+vascularization+by+down-regulating+local+erythropoietin+expression.">VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression.</a> Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).</li><li>Ritter, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+progenitors+differentiate+into+microglia+and+promote+vascular+repair+in+a+model+of+ischemic+retinopathy.">Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy.</a> J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).</li><li>Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NAD(P)H+oxidase+reduces+apoptosis+and+avascular+retina+in+an+animal+model+of+retinopathy+of+prematurity.">Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity.</a> Mol Vis. 13, 840-853 (2007).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+dietary+intake+of+omega-3-polyunsaturated+fatty+acids+reduces+pathological+retinal+angiogenesis.">Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis.</a> Nat Med. 13, 868-873 (2007).</li><li>Banin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T2-TrpRS+inhibits+preretinal+neovascularization+and+enhances+physiological+vascular+regrowth+in+OIR+as+assessed+by+a+new+method+of+quantification.">T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).</li><li>Dorrell, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+retinal+astrocytes+normalizes+revascularization+and+prevents+vascular+pathology+associated+with+oxygen-induced+retinopathy.">Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy.</a> Glia. 58, 43-54 (2010).</li><li>Joyal, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+neurons+prevent+vascular+regeneration+of+neural+tissue+by+secreting+semaphorin+3A.">Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A.</a> Blood. 117, 6024-6035 (2011).</li><li>Binet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ER+Stress+Impedes+Myeloid-Cell-Induced+Vascular+Regeneration+through+IRE1alpha+Degradation+of+Netrin-1.">Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1.</a> Cell Metab. 17, 353-371 (2013).</li><li>Fukushima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sema3E-PlexinD1+signaling+selectively+suppresses+disoriented+angiogenesis+in+ischemic+retinopathy+in+mice.">Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice.</a> J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).</li><li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+retinal+vaso-obliteration+and+neovascularisation+in+the+oxygen-induced+retinopathy+(OIR)+mouse+model.">Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li><li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model.">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).</li><li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+quantification+of+retinal+neovascularization.">Computer-aided quantification of retinal neovascularization.</a> Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).</li><li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Weight+Gain+Modifies+Severity+and+Functional+Outcome+of+Oxygen-Induced+Proliferative+Retinopathy.">Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy.</a> Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).</li><li>Cerani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-Derived+Semaphorin+3A+is+an+Early+Inducer+of+Vascular+Permeability+in+Diabetic+Retinopathy+via+Neuropilin-1.">Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1.</a> Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).</li><li>Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyeing+central+neurons+in+vascular+growth+and+reparative+angiogenesis.">Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis.</a> Blood. 120, 2182-2194 (2012).</li><li>Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+manifestations+of+postnatal+hyperoxia+on+the+retinal+structure+and+function+of+the+neonatal+rat.">Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).</li><li>Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+oxygen+and+light+on+the+structure+and+function+of+the+neonatal+rat+retina.">The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina.</a> Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).</li><li>Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis,+angiogenesis,+and+MRI+indices+of+functional+recovery+from+stroke.">Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke.</a> Stroke. 38, 827-831 (2007).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+improved+cerebral+blood+flow+in+the+ischemic+boundary+area+detected+by+MRI+after+administration+of+sildenafil+to+rats+with+embolic+stroke.">Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke.</a> Brain Res. 1132, 185-192 (2007).</li><li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy:+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals.">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).</li><li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks.">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).</li><li>Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+selection+for+different+mtDNA+genotypes+in+heteroplasmic+mice.">Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice.</a> Nat Genet. 16, 93-95 (1997).</li><li>Mattapallil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rd8+mutation+of+the+Crb1+gene+is+present+in+vendor+lines+of+C57BL/6N+mice+and+embryonic+stem+cells,+and+confounds+ocular+induced+mutant+phenotypes.">The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes.</a> Investigative ophthalmolog., &amp; visual science. 53, 2921-2927 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Iskemik sinir dokusunda yeni sağlıklı damarlarının büyümesini teşvik etmek için en etkili yolu nedir? Bunu engelleyebilir ve damar büyümesini meydana gelen doğal hızlandırmak için terapötik geçerli mi? Iskemik retinopati veya felç gibi nöro-iskemik patolojilerde, vasküler dejenerasyon indirgenmiş nöronal fonksiyonu 35-38 ile ilişkilidir. Bu nedenle hastalığın erken / acil kesimi sırasında bölgesel mikro-dolaşımı reinstating, erken yaralanmaya karşı yararlı olabilir. Oküler ...

CNS gelişimi, sinir, bağışıklık hücreleri ve kan damarları boyunca yeterli doku perfüzyonunu sağlamak ve duyusal bilginin 1-5 iletimine izin derece birleştiğinde ağları kurmak. Yetersiz doku oksijenasyonu ve tehlikeye metabolik arz ve vasküler sistem sonuçlarının dağılımı giderek nörodejeneratif hastalıkların 6 patogenezinde önemli bir katkı olarak kabul edilmektedir. Vasküler bırakma ve beyin içinde nörovasküler biriminin bozulma, örneğin, vasküler bunama, beyin 7 beyaz maddenin vasküler lezyonlar ve arteriyollerin ve küçük damarların stenozu 8 ile Alzheimer hastalığı ile ilişkilidir. Ayrıca, bozulmuş damar bariyer fonksiyonu, birden fazla skleroz 9 ve amiyotrofik lateral skleroz 10 katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Kör, bu protokolü açıklanan retina modele doğrudan ilgilidiyabetik retinopati 11 ve 12 prematüre retinopatisi gibi hastalıklar, 13 erken vasküler dejenerasyon aşaması ile karakterize edilir. Nörovasküler retina üzerinde eden iskemik stres olasılıkla yeniden yatırmak oksijen ve enerji arzı 14-16 bir telafi edici yanıt olarak kaynaklıdır aşırı ve patolojik neovaskülarizasyon ikinci aşaması tetikler. Hastalığın ilerlemesi için merkezi iskemik stres üstesinden gelmek için bir çekici strateji, özellikle nöro-retina (Şekiller 2 ve 3) ve iskemik bölgelerin fonksiyonel damar ağları sağlamaktır. Kontrollü bir anjiyojenik tepki düşündürücü karşı-sezgisel tür anti-VEGF&#39;lerinde gibi anti-anjiyogenik tedaviler uyarlanmış tedaviler olarak kabul edildiği bir durumu olarak rastlamak olabilir. Ancak, bu yaklaşımın geçerliliği için kanıt montaj olduğunu. Örneğin, ischem in &quot;fizyolojik gibi&quot; vasküler yeniden büyümesini artırmakic retinopatiler zarif endotel hücrelerinin öncü 17, diyet ω-3 çok-doymamış yağlı artan diğer anjiyojenik faktörler 18, miyeloid progenitörlerin 19 püskürtülmesi, NADPH oksidaz kaynaklı apoptozun inhibisyonu 20 arasında Müller hücre-ifade edilen VEGF kaynaklı baskılanması inhibisyonunun getirilmesi ile gösterilmiştir asit alımı 21, bir triptofan tRNA sentetazı 22 karboksil-terminal parçası ve glial hücreler 23 korunması için, VEGF ya da FGF-2 doğrudan uygulanması ile tedavisi. Ayrıca, bu tür iskemik retinopati Semaphorins veya netrinler gibi klasik nöronal rehberlik sufle modüle retina içinde sağlıklı damarların damar rejenerasyon hızlandırır ve dolayısıyla patolojik anjiyojenez 24, 25 azalttığını göstermiştir. Doğrudan klinik alaka, yukarıda belirtilen hayvan çalışmaları birkaç kanıt sağlayan vasküler yeniden teşvikretinopatilerin erken iskemi safhasında üretiminin anlamlı ölçüde muhtemel iskemik yükünün azaltılması yoluyla, görüş-tehdit öncesi retinal neovaskülarizasyon 19, 23, 24, 26 azaltabilir. Fonksiyonel damarların yenilenmesini teşvik tedavi stratejilerinin oluşturulması vasküler biyologlar için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada retinada damar büyümesini modüle etmek için stratejiler keşfetmek için oksijen ile tetiklenen retinopati (OIR) &#39;in fare modeli kullanan bir deneysel sistem tarif eder. Smith ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. 1994 27 yılında, bu model insan proliferatif retinopatilerin için bir vekil olarak hizmet ve ortam oda O 2-gerilim (Şekil için P12 kadar% 75 O 2 P7 fare yavrular tutulması ve yavrular yeniden tanıtan oluşur 1). Bu paradigma gevşek bir prematüre bebek havalandırılan bir senaryo taklitO 2 ile. Hiperoksiye fare yavrularının maruz retina kılcal ve mikrovasküler dejenerasyon kışkırtır ve maksimal VO alanı yapıldıktan sonra 48 saat (P9) ulaşmış olmasına rağmen tipik olarak, P12 de O 2 çıkış üzerine değerlendirildi vazo-obliterasyonunun tekrarlanabilir bir alanı (VO) verir O 2 28 maruz. Fare, avasküler VO bölgeleri kendiliğinden oda havasına yeniden giriş aşağıdaki hafta boyunca yeniden ve sonunda VO bölgeleri tamamen (Şekil 2) re-vaskülarize edilir. OIR maruz farelerin oda havasına yeniden giriş aynı zamanda tipik bir anti-anjiyogenik tedavi paradigmalarının etkinliğini belirlemek için değerlendirilir ön-retinal neovaskülarizasyon (NV) (P17&#39;de maksimal) kışkırtır. En saf haliyle, OSB modeli oksijen kaynaklı vasküler dejenerasyon değerlendirmek ve yıkıcı öncesi neovaskülarizasyona 29-31 kapsamını belirlemek için son derece tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir araç sağlar. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; CNS vasküler rejenerasyon modüle eden çeşitli araştırıcı tedavi paradigmalarının farmakolojik bileşikleri, gen terapisi, gen silme ve kullanımı dahil olmak üzere, OIR modeli kullanılarak araştırılabilir. Damar büyümesini etkilemek için, belirli bir yaklaşımın eğilimi adım adım P12 (hiperoksi çıkışından sonra maksimal VO) ve P17 (maksimal NV) arasındaki penceresinde değerlendirilir. Patolojik NV arıtma sonucu değerlendirilmesi hızlı ve kolay bir şekilde paralel olarak belirlenebilir ve iyice Stahl ve arkadaşları 30, 31 tarafından tarif edilmiştir. Burada farmakolojik bileşikler, olası terapötik, viral vektörlerin tarafından nöral retinada fizyolojik revaskülarizasyon modülasyonu araştırmak veya transgenik veya nakavt farelerde aday genlerin etkisini incelemek için basit bir adım-adım bir prosedür sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:639px;">CD1 nursing mothers</td>
			<td style="width:181px;">Vendor of choice</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Operating Scissors straight</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Dissecting Scissors straight</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Vannas Eye Scissors</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:175px;">72-8483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Iris Forceps, curved, serrated</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Brushes 362R size 0</td>
			<td style="width:181px;">Dynasty</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Dumont Forceps #3; straight</td>
			<td style="width:181px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:175px;">500338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Surgical Blade, size 10</td>
			<td style="width:181px;">Bard-Parker</td>
			<td style="width:175px;">371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td>
			<td style="width:181px;">Vector Laboratories, Inc</td>
			<td style="width:175px;">RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:175px;">16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:639px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:181px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:175px;">17984-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:639px;">Leica MZ9.5 Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:639px;">Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000</td>
			<td style="width:181px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">46945</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of vascular regeneration in the cns using the mouse retina

Kemirgen retina, belki de, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde nörovasküler etkileşimi araştırmak için hangi en kolay memeli sistemidir. Bu giderek kabul edilmektedir ki bu, Alzheimer, multipl skleroz ve vasküler uzlaşma amiyotrofik lateral skleroz, mevcut elemanları gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Buna ek olarak, çocuk ve çalışma çağındaki nüfus (sırasıyla prematürite ve diyabetik retinopati retinopati) körlük en önemli nedenleri fizyolojik vasküler yeniden büyüme damar dejenerasyonu ve başarısızlık ile karakterizedir. Bu teknik çalışmanın amacı retinadaki sinir sistemi vasküler rejenerasyonu incelemek için ayrıntılı bir protokol sunmaktır. Yöntem, iskemik yaralanma sonrası vasküler büyüme başarısız olmasına yol moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, potansiyel tedavi yöntemleri, sağlıklı damar plexuses hızlandırmak ve geri keşfedilebilir. Bulgular obtained anlatılan yaklaşım kullanılarak, şeker hastalığı ya da prematüre edilene iskemik retinopati için terapötik yollar sağlar ve muhtemelen diğer merkezi sinir sistemi vasküler hastalıkların yararlı olabilir.

OIR modeli genel olarak retina oksijen kaynaklı vasküler dejenerasyon ve iskemiye bağlı patolojik neovaskülarizasyonu çalışma için kullanılır ve oküler hastalıklar 27, 29, 30 için şu anda kullanılan anti-anjiyojenik tedavilerin geliştirilmesinde etkili olmuştur. Bu modeli kullanılarak elde edilen bulgular, gevşek gibi proliferatif diyabetik retinopati ve prematüre retinopatisi 30 olarak iskemik retinopatilerin için çıkarım olabilir. Burada damar...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina at JoVE.com

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Kemirgen retina uzun beyin için erişilebilir bir pencere olarak kabul edilmiştir. Bu teknik yazıda iskemik yaralanma sonrası, merkezi sinir sistemi içinde, vasküler rejenerasyon başarısız olmasına yol mekanizmaları incelemek için oksijen kaynaklı retinopatinin fare modeli kullanan bir protokol sağlar. Anlatılan sistem, aynı zamanda, retina ve CNS içindeki fonksiyonel kan damarlarının büyümesini teşvik etmek için stratejiler keşfetmek için dönüştüğü edilebilir.

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

assessment-of-vascular-regeneration-in-the-cns-using-the-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.3K Görüntüleme.  McGill University.  Kemirgen retina uzun beyin için erişilebilir bir pencere olarak kabul edilmiştir. Bu teknik yazıda iskemik yaralanma sonrası, merkezi sinir sistemi içinde, vasküler rejenerasyon başarısız olmasına yol mekanizmaları incelemek için oksijen kaynaklı retinopatinin fare modeli kullanan bir protokol sağlar. Anlatılan sistem, aynı zamanda, retina ve CNS içindeki fonksiyonel kan damarlarının büyümesini teşvik etmek için stratejiler keşfetmek için dönü...

Video: Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

Kornea mikrocep Testi: Fare Eye Angiogenezis Bir Model

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Kemirgen Retina ve Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullamanın Koruyucu Etkileri Fonksiyonu Değerlendirmek Üzere elektroretinogram kullanma

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

CNS içine Hedeflenen Madde Teslimat için Fare Mikrocerrahi İnfüzyon Tekniği<i&gt; yoluyla</i&gt; İç Karotis Arter

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...