Bu protokol, besleyici hücreler üzerinde kültürlenen insan pluripotent kök hücrelerinin enzimsiz geçişi için hızlı, uygun maliyetli bir yöntem sağlar. Bu protokolün avantajı, maliyetli besleyici içermeyen kültür ortamı ve büyüme substratları gerektirmemesi, enzimler tarafından tam ayrışma riskini ortadan kaldırması ve kök hücrelerin hazır duruma geçme riskini azaltmasıdır. Prosedürü gösteren, insan pluripotent kök hücreleri için Norveç çekirdek tesisinin günlük yöneticisi Hege Brincker Fjerdingstad olacak.
Tohum 0.5'e 10'a başlamak için, bundan sonra besleyici hücre ortamı olarak anılacak olan,% 10 FBS içeren 20 mililitre IMDM içeren bir T 75 kültür şişesinde, bundan sonra besleyici hücreler olarak anılacak olan 6 insan fibroblastını güce yükseltti. Besleyici hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkarın ve ortamdaki faktörler tarafından tripsinin inhibisyonunu önlemek için hücreleri 10 mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. Şişeye iki mililitre tripsin EDTA ekleyin ve besleyici hücrelerin ayrılmasını çıplak gözle gözlemlerken yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Ayrılma başladıktan sonra, tüm agregaların tek hücrelere ayrıştığından emin olmak için hücrelerin ayrışmasını mikroskop altında gözlemlemeye devam edin. Ardından, Tripsin-EDTA'yı etkisiz hale getirmek için şişeye beş mililitre taze, önceden ısıtılmış besleyici hücre ortamı ekleyin ve besleyici hücreleri pipetleyerek nazikçe askıya alın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından tüpü kapatın ve 5 dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.
Peleti bozmadan doyumu dikkatlice çıkarın ve dört mililitre taze besleyici hücre ortamında yeniden süspanse edin. Besleyici hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olduktan sonra, bunları bir hücre sayma odası kullanarak sayın ve 35 milimetrelik doku kültürü kaplarında HSC'leri ve HI PSC'leri kültürlemek için gereken hücre sayısını hesaplayın. Gama ışınlaması ile mitotik tutuklama gerçekleştirmenin ardından, uygun sayıda besleyici hücreyi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve besleyici hücre ortamını toplam beş mililitre hacme ekleyin.
Hemen oda sıcaklığında bir gama ışınlama makinesine taşıyın ve hücreleri mitotik olarak tutuklamak için ışınlayın. Besleyici hücreler bir doku kültürü başlığı altında mitotik olarak tutuklandıktan sonra, mililitre başına 5 gücüne yükseltilmiş 1.5 x 10'luk bir hücre konsantrasyonu elde etmek için besleyici hücre ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. 35 milimetrelik bir tabağa 2 mililitre besleyici hücre süspansiyonu ekleyin ve tabağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın.
Hücrelerin eşit dağılımı için, kabı inkübatör rafında ileri ve geri yavaşça ama sıkıca hareket ettirin. Ardından, inkübatör kapağını kapatmadan önce duraklatın ve aynı işlemi soldan sağa gerçekleştirin. 24 saat sonra, besleyici hücre ortamını% 10 serum replasmanı içeren IMDM ile değiştirin.
Mitotik olarak tutuklanmış besleyici hücreler içeren kültür kabından, kolonilerin transferinden 30 dakika önce% 10 serum replasman ortamı içeren IMDM'yi, bazik fiberblast büyüme faktörü veya BFGF içeren 1.2 mililitre önceden ısıtılmış HESC ortamı ile değiştirin. Daha sonra, ortamı HSC'ler veya HI PSC'ler içeren bir kültür kabından çıkarın ve bağlanmamış hücreleri ve hücre kalıntılarını gidermek için kolonileri bir mililitre DPBS ile yıkayın. Bir mililitre 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede bir dakika inkübe edin.
Daha sonra bir mililitrelik pipet kullanarak, EDTA çözeltisini BFGF içeren bir mililitre HESC ortamıyla değiştirin. Kolonileri besleyici hücre katmanından serbest bırakmak için, katman gevşeyene ve ayrı bir küme halinde kendi üzerine katlanana kadar aynı pipetle hafifçe ezin. Besleyici hücre katmanını bir pipet ucuyla kültür kuyusunun kenarına itin.
Yeni bir mililitrelik pipet kullanarak, asılı kolonileri, besleyici hücreler ve BFGF içeren HESC ortamı içeren yeni bir kültür kabına aktarın ve bir ila beş oranında bölün. Çanağı bir inkübatöre aktarın ve kolonilerin eşit dağılımını kolaylaştırmak için yavaşça bir yandan diğer yana hareket ettirin. EDTA kullanılarak hasat edilen HESC kolonileri, mekanik olarak hasat edilenlere göre boyut ve şekil olarak daha homojendi.
Hasat edilen ve yeniden kaplanan kolonilerdeki hücre yoğunluğu, EDTA bazlı hasat ve mekanik hasat için benzerdi. Mekanik olarak hasat edilen koloniler, orta bölgelerinde nekroz geliştirme eğilimi daha yüksekken, EDTA kullanılarak hasat edilen koloniler, farklı kenarlara sahip yarı saydam bir görünüm sergiledi. QPCR analizi, mekanik veya EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen koloniler için mRNA'da stabil bir saplılık belirteci ekspresyonu gösterdi.
Mekanik veya EDTA bazlı hasat kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen koloniler için protein seviyelerinde immünokimyasal boyama ile benzer gözlemler yapılmıştır. Her iki yöntem kullanılarak 20 geçişten sonra elde edilen HSC'lerden üretilen embriyoid cisimler, ektoderm, mezoderm ve endoderm için yaygın olarak değerlendirilen belirteçleri eksprese eden bir hücre karışımı içeriyordu. Ayrıca, yaygın genomik anormalliklerin QPCR tabanlı genetik analizi, referans bir diploid kromozomal modelden mütevazı bir sapma sergiledi.
EDTA'ya maruz kalmayı bir dakika ile sınırlamak önemlidir. Daha uzun süre maruz kalmak çok fazla ayrışmaya neden olabilir. Besleyici hücre katmanını bir kenara çekmek de önemlidir, böylece insan embriyonik kök hücrelerini veya insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri yeni bir kültür kabına aktarırken engel olmaz.
EDTA'nın patojen için yaygın olarak kullanıldığı kültüre ve yemsiz koşullara geçiş basittir ve hücrelerin nasıl tedavi edildiğine dair hiçbir değişiklik yoktur.
