Yazarlar yararlı tartışma ve el yazması gözden Julia Hatler ve Martin Ramsden (R &amp; D Systems) kabul etmek istiyorum.

1.. EMT indüksiyonu <ol><li> Bir su banyosu içerisinde 37 ° C&#39;ye kadar sıcak kültür ortamı. Kullanılan kültür ortamı ilgi hücrelerin standart bir kültür için kullanılan ortam olarak aynıdır. Örneğin, A549 insan akciğer karsinoma hücre çizgisi% 10 cenin sığır serumu ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş F12 Kaighn en yetiştirilir. </li><li> Bir ayrışma solüsyonu (örneğin TrypLE Express) kullanarak ilgi Hasat hücreleri. </li><li> Bir 15 ml konik bir tüp içinde önceden ısıtılmış kültür ortamında hücrelerin süspansiyonu. </li><li> 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Dikkatli bir atık kabı içine dökerek süpernatant kaldırmak. </li><li> Önceden ısıtılmış kültür ortamı içinde hücre pelletini askıya alınması. </li><li> Trypan Mavi kullanarak canlı hücreleri saymak. Hücre süspansiyonunun bir numune alın ve 0.4% Trypan Blue çözeltisi içinde seyreltin. Bir menositometrede seyreltilmiş numunenin 10 ul yerleştirin ve canlı hücreler (mavi açmazlar hücreler) saymak. Hücre d belirlemek için hücre sayıları kullanınçözümde densite. </li><li> Doku kültürü üzerine plaka hücreleri cm2 başına 0.9-1.0 x 10 4 hücre plakaları veya şişeleri tedavi. Örneğin, 0.5 x 10 6 hücre 1X EMT inducing Media Supplement (6 ml ortam 100 mm plaka başına) içeren kültür ortamı içinde, 100 mm levha kaplanmıştır. </li><li> Kültür, 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde hücreleri kaplama. Günlük hücre morfolojisi izleyin. </li><li> Üç gün sonra kaplama, medya kaldırmak ve 1X EMT Endükleyen Medya Desteği içeren taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin. Bir 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde kültüre devam edin. </li><li> Beş gün sonra kaplama, hücreler analiz için hazırdır. Hücre morfolojisi ters ışık mikroskobu ile görüntülenmiştir. </li></ol> 2. Immünositokimya Protein İfade Analizi <ol><li> % 95 etanol ihtiva eden bir petri lamelleri yerleştirerek bir 24-delikli plaka için steril 12 mm lamelleri hazırlayın. Yavaşça bizden etanol itibaren lamelleri çıkarınBir iğne ve kavisli bir forseps ve alev sterilize ing. Bir 24-yuvalı plakanın bir oyuğuna steril lamel yerleştirin. Kalan lamelleri ile tekrarlayın. </li><li> 1.7 - Bölüm 1.1 &#39;de tarif edildiği gibi hücre süspansiyonu hazırlayın. </li><li> Levha 1.6 x 10 4 hücre / ml &#39;de 0.5 1X EMT inducing Media Ek içeren önceden ısıtılmış kültür ortamı içinde. </li><li> Büyüme ve bölümlerde 1.9 açıklandığı gibi hücreleri beslemek - 1.11. </li><li> Beş gün sonra kaplama, ortamını çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 300 ul / oyuk içinde% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltmek. </li><li> Fiksatif çıkarın ve hücreler 1X PBS, 500 ul / kuyu ile 2x durulayın. </li><li> Bloke edici tampon içinde 400 ul / gözenek hücreleri inkübe edin, oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 1 sığır serum albümini (BSA),% 10 normal eşek serumu, 0.3% Triton X-100 içeren PBS 1X). </li><li> Üreticileri de primer antikor içinde inkübe oda sıcaklık 3 saat boyunca bloke etme tampon maddesi içinde de 400 ul / konsantrasyon tavsiyee ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de Doğrudan bir florokrom konjuge bir birincil antikor kullanılırken, karanlıkta örnekleri inkübe edin. </li><li> Her yıkama 5 dakika için% 0.1 BSA içeren PBS 1X 500 ul / oyuk içinde hücreler üç kez yıkayın. Doğrudan bir florokrom konjuge bir birincil antikor kullanılırken, 2,12 doğrudan adım devam edin. </li><li> Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 BSA içeren PBS 1X 400 ul / oyuk içinde üreticinin tavsiye ettiği konsantrasyonunda ikinci bir antikor olarak hücreleri inkübe edin. </li><li> Her yıkama 5 dakika için% 0.1 BSA içeren PBS 1X 500 ul / oyuk içinde hücreler üç kez yıkayın. </li><li> Eğer arzu edilirse, DAPI çözeltisi ile çekirdek counterstain. </li><li> Deiyonize su hücreleri durulayın ve lamelleri montaj medyayı kullanarak bir slayt aşağı yüz montaj. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li><li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin/&#946;-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier.">E-cadherin/&#946;-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li><li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast.">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li><li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition.">TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition.">TGF-&#946;1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li><li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells:+involvement+of+type+I+receptors.">TGF-&#946; induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li><li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+&#946;1,+&#946;2,+and+&#946;3+during+murine+palate+formation.">Differential expression of genes encoding TGFs &#946;1, &#946;2, and &#946;3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li><li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc, kâr amacı gütmeyen, kamu şirketidir. Üretim ve bu yazıda Ücretsiz Erişim R &amp; D Systems, Inc tarafından desteklenmektedir

EMT indüksiyonu için önceki yöntemleri genel olarak TGF-β uyarılmasını ya da genetik modifikasyon kullandık. Tek başına TGF-β bazı hücre tiplerinde EMT uyarılması için gösterilmiş olmakla birlikte, şimdi TGF-β EMT için gerekli olduğu gösterilmiştir, ancak, tüm hücre tipleri 6,14 yeterli değildir. EMT indüksiyonu için genetik modifikasyonu kullanılarak, zaman alıcı ve emek yoğundur. Burada anlatılan bir yöntem olup, anti-insan E-kadherin, anti-insan sFRP-1, anti-insan DKK-1, yeniden birleştirici insan Wnt-5a, ve güvenilir EMT uyarılması için rekombinant insan TGF-β1 gibi faktörlerin bir kombinasyonunu kullanır. Bu faktörler kombinasyonu E-kadherin-tabanlı yapışma, EMT indüksiyon 4 için kritik bir adım engellemek için tasarlanmıştır ve Wnt-5a protein ekleme hem de Wnt inhibitörlerine karşı bloke edici antikorlar kullanılarak Wnt sinyal geliştirmek olup, sFRP-1 ile Dkk -1. Wnt ve TGF-β sinyal mezenkimal hücre, stat indüklemek ve korumak için bir otokrin döngüsüne hareket gösterilmiştire 6. Bu indüksiyon yöntem genetik manipülasyon ortadan kaldırır ve tek başına TGF-β ile daha etkilidir. Daha da önemlisi, daha önce (Şekil 5) 14 TGF-β uyarıya yanıt için değil sadece gösterilmiştir MCF7 ve PANC-1 hücreleri de dahil olmak üzere, hücre tiplerinde EMT indüksiyonu gözlemlemek mümkün bulunmaktadır. EMT inducing Media Supplement göstermek daha az kompakt ve daha yüksek iğ şeklindeki morfoloji (Şekil 1) ile muamele edilmiş hücreler. Buna ek olarak, EMT (Şekil 2 ve 3) belirgin özelliğidir Fibronektin ifadesinde bir artış olan bir yüzey E-kadherin ifade eş zamanlı bir azalma vardır. Örneğin vimentin ve salyangoz gibi ek işaretçileri de mezenkimal uyarılmamış kontrol ile karşılaştırıldığında, EMT neden hücreleri (Şekil 4) yukarı-regüle edilmiştir. Artan göç ve istila yetenekleri mezenkimal hücrelerin ana fonksiyonel özellikleri vardır. In vitro olarak </em&gt; Göç ve istila deneyler, EMT inducing Media Ek ile tedavi edilen hücreler (Şekil 6) ve geçiş işgal belirgin bir şekilde artan bir kapasitenin mevcudiyeti gösterdi. Şekil 7 &#39;de gösterilen bir dizi antikor ekspresyon verileri kullanarak gösterildiği gibi, EMT indüksiyonu için bu basit yöntem, EMT sinyallemesinin çalışma için yararlıdır. Farklı hücre tipleri bu gibi fosforilli CREB artış ve MCF7 ve A549 EMT kaynaklı hücreler hem de görülen ERK1 / 2 olarak EMT ilişkili ortak sentezleme imza elde etmek için ön-ve post-EMT indüksiyonu karşılaştırılabilir. CREB S133 fosforilasyonu bağlanma DNA uyarır ve TGF-β1 kaynaklı EMT 15 aşağı hareket gösterilmiştir. ERK1 / 2 fosforilasyonunun da TGF-β1 kaynaklı EMT 16 aşağı hareket gösterilmiştir. P70S6 karşı A549 hücrelerinde GSK-3β fosforilasyonundaki artışı ile görüldüğü gibi hücre tipleri arasında sinyal yollarının farklılıklar da izah edilebilirMCF7 K fosforilasyon. Serin 9 da GSK-3β fosforilasyon de fonksiyon azalır ve GSK-3β pro-EMT transkripsiyon faktörü, salyangoz 17 inhibe ettiği gösterilmiştir. Bunun aksine, p70S6K Salyangoz aktivitesi neden olur ve bu da fosforilasyonun, bu proteinin 18 aktivasyonu ile ilişkilidir. Genel olarak, özellikle de daha önce sadece TGF-β cevap gösterilmemiştir hücrelerinde EMT, ve basit ve güvenilir bir indüksiyon, EMT biyolojisini anlama prognoz markerleri olarak kullanımı için ortak sentezleme imzalar belirlenmesi ve kanser için yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi için yararlı ve fibrotik hastalık.

Mezenkimal geçiş (EMT) için bir epitel polarize epitel hücresi yüksek hareketli, fibroblast benzeri mezenkimal hücre sonuçlanan değişiklikler çeşitli maruz olan bir süreçtir. Bu işlem, göç ve işgal için artan bir yetenek ile sonuçlanır, gen ekspresyonu değişiklikler ve adherens birleşme degradasyonu yoluyla, kısmen meydana gelir. Fizyolojik, EMT embriyonik gelişim ve yara iyileşmesi sırasında önemli rol oynar. EMT üzerinde kontrol kaybı, fibrozis ve karsinom 1,2 metastaz yol açabilir. Epitel hücrelerinin yüzeyi üzerinde E-kaderin indirgeme EMT 3,4 ile hücrenin ilerlemesinde önemli bir adımdır. E-kadherin direkt komşu hücreler üzerinde cadherin proteinleri ile etkileşime giren bir tek-geçişli bir transmembran proteindir. Hücre yapışmasında rolüne ek olarak, E-kadherin etkiler hücre E-kadherin An sitoplazmik kuyruğu arasındaki etkileşim ile sinyalizasyondüzenleyici proteinler da çeşitli, özellikle β-katenin. β-katenin adherens birleşme stabilizasyonu bir rol oynar. Doğal Wnt sinyallemesinin sırasında β-katenin E-kaderin salınır ve Wnt yolu 3,4,5 in bir alt transkripsiyon faktörü olarak hareket çekirdeğe transloke. Çekirdeğin içinde, β-katenin Büküm, Bilgi, Fibronektin ve matris metaloproteazların 3,6 çeşitli dahil olmak üzere birçok EMT ilgili faktörler transkripsiyonunu artırmak için gösterilmiştir. Wnts ek olarak, TGF-β sinyal normal gelişim sırasında ve hastalık durumlarının 7,8,9 hem de EMT indüklenmesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. TGF-β damak oluşumu sırasında ve gelişen kalp 10 meydana EMT katılır. Ayrıca, fibroz ve metastaz 7 kanser ilerlemesinde rol oynadığı ispatlanmıştır. Pr Burada tarif edilen prosedürovides genetik manipülasyon için gerek kalmadan hücre tiplerinin çeşitli EMT tutarlı indüksiyonu. Bu prosedür, E-kaderin bir kokteylini kullanan, sFRP-1 ve Dkk-1 bloke edici antikorlar ve Wnt-5a ve TGF-β1 rekombinant proteinleri. Bu kokteyl Wnt ve TGF-β sinyalini yükselten E-kadherin-tabanlı yapışmasını engellemek için tasarlanmıştır. Sağlam EMT indüksiyonu için yeteneği, bu işlemin nasıl biyoloji ve tedavi amaçlı olarak işlemek için anlamak için çok önemlidir. EMT Mevcut ortak belirteçleri, E-kadherin (EMT olarak azaldı) ve (EMT upregüle) Vimentin, kanserlerde birlikte ifade bulunabilir ve bu yüzden potansiyel olarak metastatik hücrelerin 12 en iyi ve en tanı markerleri olarak sağlamaz. Önemli olarak, EMT geçirmiş hücre tiplerinin çeşitli analiz kanser ve fibroz 11 tanı amacıyla kullanılabilecek ortak bir gen ekspresyon imzaları geliştirmek için yararlıdır. Buna ek olarak, son çalışmalar göstermiştir ki EMT EMT geçirmiş hücreler, bu hücreler, 13 hedefleyebilir bileşiklerin belirlenmesi için ilaç tarama için yararlı olabileceğini düşündürmektedir, kanser kök hücrelerinin oluşumunda rol oynayabilir.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Mezenkimal geçiş (EMT) epitel gelişimi sırasında uygun bir şekillenmesinde için gereklidir. Bu sürecin düzenlenmemesi fibroz önemli bir olay ve metastatik bir duruma karsinomların ilerlemesinin olarak işaret edilmiştir. EMT altında yatan süreçleri anlamak, erken tanı ve bu hastalık durumlarının klinik kontrolü için şarttır. In vitro EMT Güvenilir indüksiyon tanı amaçlı ortak bir gen ekspresyon imzaları belirlemek için yararlı bir ilaç keşfi için bir araç gibi değildir. Burada hücre tiplerinin çeşitli EMT endüksiyonu için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Hücre bağışıklık kimyası öncesi ve sonrası EMT indüksiyon analizi için yöntemler de dahildir. Ayrıca, antikor bazlı dizi analizi ve göç / istila deneyleri aracılığıyla bu yöntemin etkinliğini göstermektedir.

. T98G glioblastoma hücreleri, HT29 kolon adenokarsinomu hücre: Burada anlatılan EMT uyaran kültür koşulları hücre tiplerinin çeşitli EMT endüksiyonu için güçlü bir yöntem sağlar 1 ve 2, 4, farklı insan hücre çizgileri için bir morfoloji ve markör ifade seviyelerini gösteren Şekil , A549 akciğer karsinoma hücreleri ve MCF10A meme epitelyum hücreleri. Bir Mesenchymal, iğ şeklinde morfolojisi (- 1 H Şekil 1E) için - EMT Endükleyen Medya Desteği ile tedavi edildi hücreler klasik epitel morfolojisi (1D Şekil 1A) değiştirildi. EMT kaynaklı hücreler uyarılmamış hücrelere göre daha az yoğun sıkı koloniler içine paketlenmiş ortaya çıktı. Indüklenmeyen MCF10A örnekleri daha gevşek paketlenmiş hücreleri ile çevrili sıkıca paketlenmiş kümeleri içeriyordu. Bunlar, sıkıca paketlenmiş kümeler (Şekil 2B) E-kadherin pozitif ve EMT inducing Media Suppl ile işlenmesi üzerine ortadanası, (Şekil 2H). EMT da epitelyal ve mezenkimal işaretleri belirteçlerin yukarı düzenlemesinin baskılanması ile değerlendirildi. E-kadherin ifadesinin aşağı regülasyonu, tipik olarak farklı hücre tipleri 3,4 in EMT uyarılmasını takip görülmektedir 2 muamele edilmemiş hücrelerin çoğunluğunda (Şekil 2A - 2D, kırmızı) E-kaderin yüzey ekspresyonunu gösterir Şekil. Sonra yokluğuna kıyasla EMT indüksiyon (Şekil 2E - 2H, kırmızı). Verilen bir hücre serisi, T98G önce analizini engellemiştir EMT indüksiyon, e-kaderin, son derece düşük bir bazal seviyeye sahip olduğu bulunmuştur. Mezenkimal işaretleyici, Fibronektinin upregülasyonu, EMT Endükleyen Medya Supplement (, - yeşil - 2D Şekiller 2E karşı 2H Şekil 2A) ile indüksiyon sonrası da görünür oldu. E-kaderin ve fibronektinin ekspresyon seviyeleri, bağışıklık kimyası görülenbundan başka, toplam hücre lizatlarının Batı lekeleme (Şekil 3) ile teyit edilmiştir. Western blot E-kaderin ve immünsitokimya tarafından görülen Fibronektin ifade upregülasyonu infekte doğruladı. Bantlar EMT indüksiyonundan sonra göreli kat değişimi saptamak için dansitometrisi ve GAPDH için normalize kullanılarak nicelleştirilmiştir. E-kadherin seviyeleri, sırasıyla, A549 ve MCF10A hücrelerinde 6.4 ve 3.4 kat azaltılmıştır. Fibronektin seviyeleri, sırasıyla, 4.1 4.6 artmış ve 2.3 T98G kat, A549 ve MCF10A hücreler edilmiştir. Western blot HT29 hücreleri sonrası EMT indüksiyon E-kadherin protein seviyelerinde önemli bir azalma göstermemektedir, ancak sonuçlar, immünositokimya ayırt edilmesi mümkün olan E-kaderin (2F karşı Şekil 2B), yüzey ekspresyonunda bir azalma gösterirler toplam hücre lizatlarının Batı lekeleme. Ayrıca EMT durum, ek bilinen işaretleyici değerlendirmekEMT s pre-ve post-EMT indüksiyon analiz edildi. Daha önceki sonuçlarla uyumlu olarak, E-kadherin EMT neden olduğunu gösteren, incelenen tüm hücre hatlarında downregüle edildi. Buna ek olarak, mezenkimal belirteçler, Vimentin ve salyangoz, EMT inducing Media Ek ile muamele (Şekil 4), aşağıdaki A549, T98G ve MCF10A hücrelerinde yukarı-regüle edilmiştir. HT29 hücre hattı bu hücreler, EMT indüksiyonu için alternatif yollar kullanmak olduğunu gösteriyor olabilir, (veriler gösterilmemiştir) veya EMT indüksiyonu olmadan ya da bu mezenkimal markerlerin ifadesi göstermemiştir. TGF-β belirli bir hücredeki EMT oluşturmak için yeterli olan 7,8,9 kapsamları rağmen, diğer hücre tipleri TGF-β 14 ilavesinden sadece yanıt vermez. MCF7 insan meme kanseri hücreleri ve PANC-1 insan pankreas karsinoma hücreleri, hem tek başına 14, sinyalizasyon TGF-β yanıt rapor bulunmaktadır. Her iki satır vitr de EMT geçirebileceği olmadığını belirlemek içino, hücreler EMT inducing Media Ek mevcudiyetinde kültürlenmiştir. Hücreler, EMT inducing Media Ek içindeki bir yoğunlukta tek başına rekombinant TGF-β1 ile uyarıldı. Bu hücrelerde, kontrol hücrelerindekine görülenlere benzer sıkıca paketlenmiş hücre kolonileri (veriler gösterilmemiştir) ve yüzey E-kadherin seviyelerinin edildi oluşan, bunların epitel morfolojisi muhafaza (Şekiller 5C ve 5D, Şekiller 5A ve 5B karşı). Bunun aksine, EMT inducing Media Ek ile uyarılan hücreler yüzey E-kadherin düzeylerinde ciddi bir azalma (Şekil 5E ve 5F) gösterdi. Hücreler daha kompakt hale geldi ve daha mili gibi (veri gösterilmemiştir) gibi bu hücreler, aynı zamanda, daha mezenkimal morfolojisi elde edilmiştir. Bu sonuçlar, burada açıklanan yöntem, EMT uyaran EMT morfolojisi ve TGF-β-i, tipik olarak dirençli hücrelerde markör ifade değişiklikleri teşvik etmek mümkün olduğunu göstermektedirnduced EMT. Markör ifade ilgili değişimlere ek olarak, mezenkimal hücre özellikli bir geçiş ve işgal etme yeteneğidir. Göç ve üreticinin talimatlarına uygun olarak 96 oyuklu BME Hücre Yayılması Deneyi ile analiz edildi veya EMT inducing Media Ek olmadan kültürlenen hücrelerin istilası. Kısaca, hücreler 8.0 um gözenekli filtre ekler ihtiva eden (50,000 hücre / oyuk) 96 oyuklu plakalar üzerine tohumlandı. 48 saat sonra, geçiş filtreden göç eden hücrelerin boyanması kalsein AM ile değerlendirildi. Her bir numune, benzer sonuçlar ile iki kez, üç kez test edildi. Bir deney Örnek sonuçlar Şekil 6A&#39;da gösterilmektedir. Hücre göçü istatistiksel olarak anlamlı artışlar (P-değeri &lt;0.003) EMT indüksiyonundan sonra hem A549 ve PANC-1 hücreleri ile görüldü. (Örneğin hücre dışı bir matris boyunca göç) işgal bu hücrelerin kabiliyetini değerlendirmek için aynı deney olduBir bazal membran ekstresi kaplı filtre ile gerçekleştirilir. EMT kaynaklı hücre Şekil 6B&#39;de görüldüğü gibi, muamele edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında işgali yetenekleri arasında istatistiksel olarak anlamlı (p-değeri &lt;0.001) artış gösterdi. EMT sağlam indüksiyon bu hücrelerde yer alan gen ekspresyon değişiklikler ve sinyal analizi için yararlıdır. Tedavi edilen ve edilmeyen hem hücrelerinden lizatları kullanılarak antikor tabanlı dizi analizi tek bir numunede bulunan moleküllerin çeşitli ekspresyon seviyelerini analiz etmek için bir yöntemdir. Bir örnek olarak, un neden olduğu ve Proteome Profiler İnsan Phospho-MAPK dizisi Kiti kullanılarak MCF7 ve A549 hücreleri, EMT kaynaklı gelen lizatlarda fosforile edilmiş MAPK aile üyelerinin seviyeleri analiz edilmiştir. Dizi benzer sonuçlar ile bağımsız EMT-indüksiyon tedavileri iki kez çalıştırıldı. 7. bir dizi temsilci verileri göstermektedir. Her iki hücre tipi CREB (S133) artan fosforilasyonunu sergiledi, ERK1 (T2<html> 02/Y204) ve EMT kaynaklı hücrelerinde ERK2 (T185/Y187) kontrol ile karşılaştırıldığında. Sinyal olayları farklar hem de iki hücre tipleri arasında gözlenmiştir. MCF7 hücreleri, artan p70S6K (T421/S424) fosforilasyon göstermiştir ve fosforilasyon ise A549 hücreleri, GSK-3 β (S9) fosforilasyon bir artış göstermiştir. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Şekil 1. EMT inducing Media Ek ile uyarıldıktan sonra mezenkimal morfolojisi indüksiyon (A - D). Dört hücre tiplerinde epitel morfolojisi EMT inducing Media Ek olmayan, standart kültür ortamı içinde, 5 gün boyunca kültür, aşağıdaki gösterilen (E - H). Mezenkimal morfolojisi Dört hücre tipleri, 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek ile kültüre gösterdi. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Şekil 2. Epitel işaretleyici ifade ve EMT kaynaklı hücrelerinde mezenkimal markör ifadesinin yukarı regülasyonu downregülasyonu. Hücreler epitel işaretleyici, E-kadherin (kırmızı) ekspresyonunu tespit etmek için bağışıklık ile boyandı ve mezenkimal işaretleyici, Fibronektin (yeşil). (A - D) 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek olmadan kültürlenmiş kontrol hücreleri (E -. H), 5 gün için EMT inducing Media Ek ile kültürlenen hücreler. Tüm hücreler DAPI (mavi) ile ters. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Şekil 3,"/> Şekil 3,. Western blot An ile epitelyal ve mezenkimal markör ifade teyidi<html> . (-) 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek dört hücre tipleri toplam hücre lizatlarının Western blot alysis (EMT) ile ya da olmadan muamele edilmiş olduğuna işaret etmektedir. Solda gösterildiği gibi E-kaderin, Fibronektin ve GAPDH yükleme kontrolü için Gruplar bulunmaktadır. Sağdaki gösterildiği gibi boyut işaretleyici olarak kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Şekil 4,"/> Şekil 4. Mezenkimal belirteçler, EMT kaynaklı hücrelerinde vimentin ve salyangoz yukarı regülasyonu. Hücreler epitel işaretleyici, E-kadherin (gri) ifadesini tespit etmek için renkli bağışıklık ile boyandı ve mezenkimal belirteçleri, Vimentin (yeşil) ve salyangoz (kırmızı) . (A - C) 5 gün boyunca EMT inducing Media takviyesi olmadan kültürlenmiş kontrol hücreleri. (D - C) 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek ile kültürlenen hücreler. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Şekil 5," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Şekil 5,. 5 gün boyunca, TGF-β1 10 ng / ml ihtiva eden ortam içinde kültürlendi, 5 gün boyunca tek başına ortam ile kültürlenmiştir TGF-β1 duyarlı olmayan hücrelerde EMT indüksiyonu. (A ve B) Hücreleri. (C ve D) hücreler. (E ve 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek olarak kültür F) hücreler. Tüm hücreler, E-kadherin ifadesi (kırmızı) için boyandı ve DAPI (mavi) ile karşı edilir. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Şekil 6,"/> Şekil 6,. EMT kaynaklı hücre göçü ve yayılması kapasitelerini artmıştır. 48 saat için inkübe edildikten sonra bir 8 um gözenekli filtreden geçirilmiş hücre A. ortalama sayısı. B. ortalama sayısı48 saat için kuluçkalamadan sonra, bazal membran ekstresi ile kaplanmış bir 8 um gözenek filtresi üzerinden işgal mümkün hücreleri. Hata çubukları 3 tüpler üzerine standart sapmayı göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Şekil 7"/> EMT indüksiyon Şekil 7. Antikor-tabanlı dizi ekspresyon analizi. A549 (A ve C) gelen lizatlar ile veya EMT inducing Media Ek olmadan kültürlenmiş MCF7 (B ve D) hücreler Proteome Profiler İnsan Phospho-MAPK dizisi Kiti kullanılarak dizi analizi için kullanıldı. Noktalar A vurgulanır ve B sonra densitometrisi sayıldı. Un-uyarılan EMT kaynaklı lizatlarının karşılaştırmalar (C ve D), aşağıda gelen çubuk grafiklerde gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">büyük rakam &lt;görmek için buraya tıklayın</a>/ A&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition at JoVE.com

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Doğrudan bir yöntem, hücre tiplerinde çeşitli mezenkimal geçiş (EMT) epitel indüklenmesi için tarif edilmektedir. Immünositokimya EMT eyalette hücrelerin analiz yöntemleri dahildir.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

induction-and-analysis-of-epithelial-to-mesenchymal-transition

Research

JoVE Journal

Biology

35.5K Görüntüleme.  R&D Systems, Inc..  Doğrudan bir yöntem, hücre tiplerinde çeşitli mezenkimal geçiş (EMT) epitel indüklenmesi için tarif edilmektedir. Immünositokimya EMT eyalette hücrelerin analiz yöntemleri dahildir. 

Video: Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Fareler için açık / koyu Geçiş Testi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biyoloji

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...