BS Milan-Bicocca Yaz Öğrenci Araştırma Eğitim Programı Üniversitesi tarafından desteklenmiştir, araştırma Sağlık ve İtalyan Bakanlığı Eğitim, Üniversite ve GC için Araştırma ve Fondazione Humanitas, İtalyan Bakanlığı fonlarından desteklenen, biz eleştirel okumak için Michael VG Latronico teşekkür el yazması.

1. İnsan iPS Hücre Hatlarının Besleyici Bakım gerektirmez ve Pasajlanması <ol><li> Matrigel kaplı yemekler hazırlayın. Çözünme bir bir saat boyunca buz üzerinde insan ESC nitelikli Matris şişe ve 25 ml DMEM-F12 ortamı içinde seyreltin. Buz üzerinde her şeyi tutmak ve tüm plakaları ve tüpler önceden soğutulmuş olmasını sağlamak, her 35 mm levha (veya diğer yemekler kullanılması durumunda yüzey alanı başına eşdeğer miktarda) ile 1 ml ekleyin. Alüminyum folyo ile plakalar Kapak. </li></ol> Not: Matrigel stok konsantrasyonları toplu göre farklılık gösterir. Seyreltme talimatları veri tablosunda gösterilir. <ol start="2"><li> Gece buz üzerinde plakaları tutmak ve ertesi gün buz kaldırmak. Tabaklar kullanmadan önce bir hafta için buzdolabında kadar tutulabilir. </li><li> MTESR1 tam orta (veya Nutristem orta bir şişe çözülme) ve aşağıdaki tabloya göre H-ESM (insan ESC orta) hazırlayın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> 500 ml İÇİN </td></tr><tr><td> Nakavt Serum Yedek (KSR) </td><td> % 20. </td><td> 100 mi </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> MEM olmayan esansiyel amino asitler </td><td> 0.1 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> 100 U / mL - 0.1 mg / ml &#39; </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 0.1 mM </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> B27 Ek - Vitamina olmadan </td><td> % 1 </td><td> 10 mi </td></tr><tr><td> N2 desteği </td><td> % 1 </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Nakavt DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Hazır orta en fazla 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Tam büyüme ortamı hazırlamak için, bazik FGF sadece befor ilave edilir20 ng / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda e beslenmesi. </li></ol> Not: fare embriyonik fibroblastlar şartına H-ESM Komple iPS hücreleri yerine mTESR1 veya Nutristem bir kullanılabilir. <ol start="4"><li> Pasajlanmasını da öncesinde 30 dakika ile 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatör kaplı plakalar yerleştirin. </li><li> Hücreleri izdiham ulaşmamış olsa bile, yaklaşık her 5 gün geçişli olmalıdır. Koloniler dokunmadan edilmemelidir. </li><li> Dispase, 1 ml (1 mg / ml, PBS içinde 10 mg / ml stok erimesi) büyüme ortamı ile değiştirin. </li><li> Çekti cam Pasteur pipetler ile alanları ayırt çıkarın. Çıkarılmalıdır Alanı kolonilerin merkezi bir krater benzeri veya kistik yapıları içerir, ve hücreler haline gelmiştir her alanda koloniler ayrılır ve düzleştirilmiş ve dışa doğru göç gibi görünmektedir. </li><li> Koloni sınırları parlak olur ve (genellikle 5-7 dakika civarında) ayırmak için başlayana kadar bir kültürü kaputu altında 37 ° C&#39;de inkübe edin. Discard dispase. 1 ml H-ESM ile yıkayın ve atın. </li><li> 1 ml H-ESM olarak, hasat koloniler bir hücre kaldırıcı (kazıyıcı spatula gibi) kullanımı ve 15 ml Eppendorf tüp toplamak. 1 ml H-ESM ile durulayın ve tüp ekleyin. 4 dakika 1000 RCF Spin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> 1 ml önceden ısıtılmış büyüme ortamı (ya da mTESR1 veya Nutristem) içinde süspanse pelet. Çok fazla kümeleri kesiliyor kaçının - ve aşağı yukarı pipetle az 6-8x daha. Kaç hücre kaplama olması ve 1:5 2 tabak için örneğin gereksiz hücreleri (genellikle 1:4 ile 1:5 seyreltme), kaldırmalısınız belirleyin, 600 ul kaldırmak, daha sonra 1.6 ml taze orta ekleyin. </li><li> Plakalardan Matrigel çıkarın. Yeri hücreleri plaka üzerinde eşit dağıtarak, damla damla. Bu hücreler merkezine doğru hareket etmesine neden olacak gibi, aşırı tüp sallayarak kaçının. </li><li> Plaka arasında 1 mi, orta ve bölme ile tüp yıkayın. Her plaka nihai hacim 1.5 ml -2 olmalıdır. </li><li> Pasajlanması gün sonra hariç, her gün orta değiştirin. Her ne kadaren fazla 2-3 gün pluripotency veya farklılaşma potansiyel etkilemeden son pasaj geçtiyse orta her gün değiştirmek için ideal bir, bu arada bir kez her iki günde bir frekansta değiştirilebilir. </li><li> Hücre hattı dondurulabilir ise, 2 ml pipet ve yerine 1 ml / dondurarak saklamaya uygun vialler ile 1-2 ml mFreSR dondurma ortamı içinde yerine yeniden askıya. -80 Bir cryobox yer şişeleri ° C ve 3-4 gün içinde sıvı azot transfer. </li></ol> Not: iPS hücreleri, Manual of mikrodiseksiyon bir stereo mikroskop altında gerçekleştirilmelidir. Bu ısıtılmış bir yüzey alanı üzerinde tutulurken, bir stereomikroskop ile entegre bir in vitro fertilizasyon (IVF), iş istasyonu (örneğin KSystem bir IVF Workstation) steril koşullar altında hücrelerin manipülasyonuna olanak sağlar. Bu mevcut değilse, bir stereo düzenli bir laminar akış başlığı altında hareket ettirilebilir. 2. Embriyoid Organları Toplama ve Kardiyak induction <ol><li> Aşağıdaki tabloya göre EBM-20 ortamı hazırlayın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> 500 ml İÇİN </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (kökeni Güney Amerika) </td><td> % 20. </td><td> 100 mi </td></tr><tr><td> MEM gerekli olmayan amino asitler </td><td> 0.1 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Penisilin - Streptomisin </td><td> 100U/ml - 0.1 mg / ml &#39; </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0.1 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 50um </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Güney Amerika kökenli FBS kullanımı farklılaşma verim belirlemek için önemlidir: serumun türleri diğer iş etkileyebilirfarklılaşma. 50 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar tam EBM-20, eklentinin askorbik asit (AA) hazırlanması. Tam büyüme ortamında en fazla bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Hasat iPS koloniler olarak (adımları 1,6-1,9) yukarıda açıklanan. </li><li> 2 ml pipet ile 1 ml EBM-20 yavaşça tekrar. Çok fazla kümeleri kesiliyor kaçının - stereomicroscope altında koloniler büyüklüğü kontrol, en fazla 2-3x daha aşağı yukarı pipet ve. 1:1 oranında ultra-düşük ek plakalar üzerinde plakası (35 mm yemek için örneğin, bir 6-plaka iyi 1 kullanın). 1 ml EBM-20 ile tüp durulayın ve plaka ekleyin. </li></ol> Not: kolonilerin boyutu verimlilik ve kalp indüksiyon zamanlaması kontrol farklılaşma etkiler. Homojen boyutlu EBS Agregasyon farklılaşması sırasında gözlenen değişkenliği azaltmak için gösterilmiştir. <ol start="4"><li> 3. günde, yeniden önlemek için bir mikroskop kullanılarak EBM-20 kez değiştirmekEBS moval. Plaka kenar yakın pipet ve orta kaldırmak tutun. </li><li> 7. günde, anahtar EBS% 0.1 jelatin ve daha önce 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de yerleştirilir ile kaplı plakalar için. Gerekirse, jelatin bir hücre kültürü kaputu altında çıkarıldı ve plakalar bırakılabilir O / N 35 mm tabak başına 35-40 EBS ekleyin. </li><li> Haftada iki kez alanları ve değişim EBM-20 yenerek için EBS kontrol edin. Stereomicroscope altında onlar lokalizasyonu kolaylaştırmak için, dayak alanları çanak kapağının üstünde bulunan nerede işaretleyin. Taahhüt alanlarda yaklaşık 10-20 gün sonra görünmelidir. </li><li> Spontan kasılma olduğu bölgelerde, görünür (yerine% 2 FBS ile, EBM-20 olarak hazırlamak) EBM-2 orta geçiş ve bunları 3. bölümde aşağıda açıklanan izole. Zaman </li><li> Dayak ve dayak alanlar daha fazla deneyler için gerekli olan kadar haftada iki kez orta değiştirmek için diğer alanlarda kontrol etmek için devam edin. </li></ol> Not: farklılaşma sürecinin Verimliliği oldukça bağımlıdırçeşitli faktörler, hangi en kritik kalp farklılaşma indüklemek için kullanılan özel hücre hatları ve serum olan toplu. En yüksek verimlilik elde etmek için, cardiomyogenic potansiyeli ve serum çeşitli partiler için testi hücre hatları. 3. Alanları İzolasyon ve Kültür Dayak <ol><li> Coat 12 oyuklu plakalar (4 cm2 alan) ya da 5 ug / cm 2 fibronektin ile söz konusu plakalar (12 oyuklu plakalar içerisine oyuk başına 300 ul toplam) tamamen tüm yüzeyini kaplamak için yeterli hacimde PBS içinde seyreltilmiştir. Hücre kültürü kaputu ortaya tutmak ve kurumasını bekleyin. Plakalar 4 de sarılmış ve saklanabilir ° CO / N. </li><li> Gerektiğinde bir bardak kullanarak alanı yenerek kaldırmak, Pasteur pipeti ve neşter çekti. 1 ml&#39;lik bir pipet ile fibronektin-kaplı plakalara transfer. </li><li> 1 ml EBM-2 ekleyin. </li><li> Hücreler çıkarıldı alanları gösterir ve orta değiştirmek için plaka çapraz. Diğer alanlarda b başlayabilir olarak plakalar, 1 aya kadar saklanabilirdaha sonra yemek. </li></ol> Not: Daha küçük yenerek kümeleri gerekli ise küçük parçalar halinde tatili kadar, stereomicroscope altında birkaç kez aşağı Eksplante alanı pipet ve. Bu birkaç dayak hücreleri (film 3) kümeleri ile sonuçlanacaktır. <ol start="5"><li> Analizler için hazır olana kadar haftada iki kez orta değiştirin. </li></ol> Not: Bu protokol elde kardiyomiyositleri fetal gibi morfolojik ve fonksiyonel özelliklere sahip, bir yetişkin-benzeri fenotip doğru olgunlaşmasını daha bu hücreleri ayırt etmek için kültür süresi artırılarak elde edilebilir. 4. Tek Dayak Hücreleri İzolasyon ve Analiz <ol><li> Coat 2 odacıklı slaytlar (4 cm 2 alan) ya da tüm kültür yüzeyini kapsayacak şekilde yeterli PBS içinde seyreltilmiş 5 mg / cm 2 fibronektin ile diğer uygun destekler. Bir cam destek kullanılırsa, laminin ve fibronektin ile kat (5 ug / cm &#39;&gt; 2 adet) destek. </li><li> Bölüm 3 plakalardan Pasteur pipeti / neşter ile alanı yenerek çıkarın. </li><li> 1 ml&#39;lik bir pipet, inkübasyon sırasında bir kez çalkalama tüpü 500 ul kolajenaz II (Mg, Ca ile PBS içinde 480 U / ml) ve 37 dakika inkübe 15 ° C içeren 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer hücrelerin kullanılması. </li><li> 200 ul pipet ile yukarı ve aşağı pipetle. Herhangi kümeleri kalırsa, taze kollajenaz II aktarmak ve adım 4.3 tekrarlayın. </li><li> Hiçbir büyük kümeleri bırakılır kadar adım 4.4 tekrarlayın. </li><li> 3 ml EBM-2 (yok AA) ile kollajenaz inaktive eder. Diğer tüpler hazır olana kadar tüp daha sonra ateşli bir rafa başlık altında bırakılabilir. 4 dakika 1000 RCF santrifüj. </li><li> Süspanse pelet 1 ml% 0.25 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de tripsin / EDTA (1X PBS içinde% 0.5&#39; lik stok solüsyonlarından seyreltilmiş) ile inkübe edin. Aynı ilk örnekten sindirimler kesirler birleştirin. </li><li> 4 ml EBM-2 (yok AA) ile tripsin inaktive eder. Daha t hiç bir 2.5 ml şırınga bir 18G iğne ile hücre geçmekhan 7x. 4 dakika 1000 RCF santrifüj. </li><li> Tekrar süspansiyon hücre pelet başına iyi ve plaka 1 ml EBM-2. Hücreler 2-3 gün sonra kaplama fonksiyonel ve morfolojik analiz için kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

Açıklama yok mali çıkarlarının.

Pluripotent kök hücreler hatları arasında düşük verimlilik ve yüksek değişkenliği ile de olsa, CMs kendiliğinden ayırt potansiyeline sahiptir. Yeni indüksiyon yöntemlerinin geliştirilmesi bu nedenle sürecinin verimliliğini artırmak ve daha tanımlı protokoller doğru hareket odaklanmıştır. Bununla birlikte, bu yeni farklılaşma yöntemlerin en ayrıntılı kültür koşulları, zamanlama ve reaktif konsantrasyonu iyi kontrol ve pahalı sitokinler ve büyüme faktörleri ile tedavi gerektiren, old...

Tarihsel olarak, insan gelişimi ve hastalık sürüş genetik ve moleküler mekanizmalar soruşturma genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinin nesil dayanmaktadır. Ancak, çok sayıda insan fenotipleri başarıyla başlıca nedeni iki tür arasında var olan biyolojik farklılıkların, farelerde çoğaltılması için başarısız. Diğer taraftan, insan doku erişim sınırlı olabilir ve genellikle yeterli malzeme derinlemesine Deneysel çalışmalarda elde edilmesine izin yoktur. Kardiyovasküler biyoloji alanında bu sınırlamalar her iki muzdarip: insan kalbinin fizyolojisi fare bu önemli ölçüde farklı olduğu ve kalp dokusu önemli bir miktar sadece ölüm sonrası ya da kalp ameliyatı sırasında erişilebilir. Fonksiyonel insan CMs farklılaşması için en uygun kaynak bulmak bu nedenle kardiyovasküler biyoloji merkezi bir konu haline gelmiştir, ve çok çaba bu sorunu gidermek için yapılmıştır. Çeşitli hücre tipleri i, önerilmiştirncluding iskelet iskelet hücreleri yanında, yerel kardiyak kök hücreler, kemik iliği mononükleer hücreler, endotelyal ataları ve mezenkimal kök hücreler. Ancak, veri 4 tutarlı olmamıştır, bu hücreler kullanılarak elde edilmiştir. Insan embriyonik kök hücreleri (ESC) türetilmesi ilk 5 ve Yamanaka ve Thomson 6,7 ile uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerin çığır açan keşfi daha sonra çözümler sunmak gibiydi: bu hücrelerin vermek için süresiz büyümeye yeteneği ve potansiyeline sahip CMs dahil olmak üzere üç germ her hücresi türevleri, yükselecek. IPS hücrelerinin kullanılması daha başka avantajları sunmaktadır: otolog yetişkin hücrelerinden türetilen, bunlar türetildiği tek tek ya da hasta ile aynı gen taşır. Bu nedenle, insan genetik hastalıklar ve gelişme mekanizmalarının incelenmesi kolaylaştırmak in vitro modeller gelişimini sağlar. Bu özelliği sayesinde ise, iPS hücreleri de o olabilirbağışıklık ret ve etik konular 8 ile ilgili vercome sorunları. EKH hala kök hücre biyolojisi alanında altın standart temsil etse de bu nedenlerden dolayı, araştırmacılar dünya çapında şu anda iPS hücresi teknolojisi karşı daha hareket ediyor. iPS hücreleri, hemen konjenital kardiyovasküler bozukluklar da dahil olmak üzere, çeşitli koşullar 9,10 için, in vitro olarak insan hastalığı olan model için kullanılmaktadırlar. Son zamanlarda, iPS hücre hastalığı modelleme uygulaması monogenik kalp hastalıkları (örneğin uzun QT sendromları, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi) ve kalp kusurları karmaşık bir fenotip (yani Leopard ve Timothy sendromlar, dilate kardiyomiyopati) bir parçası olduğu patolojiler için yapılmıştır. Bu raporlar CMs ayrılırlar hastaya özgü iPS hücreleri in vivo hastalık olarak benzer fenotipik ve fonksiyonel özellikler gösterdiği doğruladı. Ancak,kalp soy içine iPS hücreleri tetikleme etkinliğini artırmak için hala pek çok sorun vardır. Agrega oluşumu yoluyla insan EKH gelen CMs spontan nesil embriyoid organları (EBS) başarılı 17 kanıtlanmıştır çağırdı. Bu keşfinden beri, pek çok yöntem önerilmiştir. Birçok grup büyük ölçüde farklılaşma protokol verimliliği gelişmiş ve (Mummery bakınız, C., ve diğerleri., Mevcut tüm yöntemleri 3 kapsamlı bir inceleme için sirkülasyon Araştırma (2012) kimyasal olarak tanımlanmış ve hayvan-ürün içermeyen kültür reaktifler doğru taşındı .) Bununla birlikte, EB toplama dayalı klasik yöntem hala en sık fonksiyonel çalışmalar yapmak ve hastalık mekanizmaları araştırmak için istihdam temsil eder. Bizim önerilen protokol kalp farklılaşma sürecini geliştirmek için gösterilmiştir, serum ve askorbik asit varlığında EBS içine iPS hücreleri, agregasyon ve kültür ve po alınmaktadır18,19 regüle edilebilen bu hücrelerin olgunlaşmasını etkileyebilir. Bu yazıda ayrıntılı olarak bu metodoloji üzerinden gidecek ve hastaya özgü iPS-türetilmiş CMs üretmek için besleyici-ücretsiz iPS hücre hatları nasıl kullanılacağını gösterecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

Kalp gelişimine sürüş olaylarının araştırılması için ve insanlarda miyokard hastalıklara yol açan moleküler mekanizmaların belirlenmesi amacıyla, fonksiyonel insan kardiyomiyositlerde (CMS) oluşturmak için birinci şarttır. Ilaç keşfi ve toksikoloji çalışmaları, bu hücrelerin kullanımı da insan kaynaklı hücreler üzerinde ön-klinik olarak geçerli olmak üzere kardiyak bozuklukların tedavisinde yeni moleküller sağlayan, yüksek ölçüde yararlı olacaktır. CMs olası kaynaklarının, uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri kolayca erişilebilir hasta doku doğrudan elde edilebilir gibi, en umut verici arasındadır ve vücudun 1 her hücre tipleri neden bir içsel kapasiteye sahip. Çeşitli yöntemler kimyasal olarak tanımlanmış protokoller 2,3 için klasik embriyoid organları (EBS) toplama yaklaşımı arasında değişen, CMs içine iPS hücreleri ayırt etmek için önerilmiştir. Bu yazıda bir EBS-tabanlı protokol teklif ve göstermek nasıl bu metodolojid verimli besleyici ücretsiz iPS hücrelerinden işlevsel CM-benzeri hücreler üretmek için kullanılabilir.

Çalışmalarımızda biz birkaç iPS hücre hatları CMs oluşturulan. Bu hatlar, başlangıçta bir MEF besleyici tabaka üzerinde oluşturulan ama şimdi tanımlanmış bir ortam (mTESR1 ya da Nutristem) kullanılarak Matrigel yerleştirildi. Çeşitli tahliller, morfolojik özellikleri, pluripotent hücreler tipik markırlerinin (OKT-4, SSEA4 ve TRA1-60) ve bunların genomuna stabilite (Şekil 1) bakımı doğrulamak için kullanıldı. Kalp soy içine indüksiyon EBS ve...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K Görüntüleme.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

Video: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Biyoloji

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.

İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

hiPSC Kullanan MSC'lerde Yüzey Antijenlerinin ve Proliferasyon Yeteneğinin Karakterize Edilmesi

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

Yazar Spotlight: iPSC'lerdeki Gelişmeler ve Genetik Hastalık Araştırmaları 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...