Daha önce in vitro veya ex vivo modellerde dermal hücre bileşenleri ve cilt dokusunun karmaşıklığı yoktur. Bu ex situ SCAD testi, belirli bir sınırlamanın üstesinden gelir ve yaralı hayvanın dışındaki yara izlerinin gelişiminin incelenmesini sağlar. SCAD testi, cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünün ve skar oluşumunun görselleştirilmesini sağlar.
Skar oluşumunun mekanik temelini anlamak için aktivatörlerin veya inhibitörlerin tarama kütüphanelerini sağlar. Temel süreci ve yara onarımında yer alan molekül seyrini anlamada SCAD modelini kullanan düz kütüphanelerin yüksek verimli tarama testleri. SCAD testinin cilt eksplantları kullanılarak gerçekleştirilmesi kolaydır.
Tutarlı bir yara izi için, doğum sonrası sıfır gün veya birinci gün cildinin seçilmesi önerilir. Doğum sonrası sıfır veya birinci gün yenidoğan yavruyu feda ettikten sonra, iskelet kası tabakasına kadar 1.5 x 1.5 santimetre tam kalınlıktaki dorsal sırt derisini dikkatlice çıkarmak için steril bir cerrahi neşter kullanın. Steril kavisli forseps kullanarak cildi soyun ve yüzeysel fasyanın altta yatan panniculus karnoz kası ile bozulmamış olmasını sağlayın.
Kirletici kanı çıkarmak için eksize edilen dokuyu 50 ila 100 mililitre soğuk DMEM F-12 ortamı ile yıkayın. Ardından, doku ve hücre canlılığını korumak için dokuyu Hanks dengeli tuz çözeltisi ile yıkayın. DMEM F-12 ortamı içeren 10 santimetrelik bir Petri kabında cildi yüzeysel fasyayla baş aşağı yerleştirin.
Daha sonra, tek kullanımlık iki milimetrelik bir biyopsi punch kullanarak, kabuklu dokular oluşturmak için tam kalınlıkta yuvarlak deri parçalarını tüketin, yüzeysel fasyanın epidermise kadar altta yatan panniculus karnozus kası ile bozulmamış olmasını sağlayın. 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna fenol kırmızısı olmadan 200 mikrolitre taze DMEM F-12 tam ortam ekleyin. Steril forseps kullanarak, bireysel kabuklu dokuyu baş aşağı 96 delikli bir plakanın kuyularına aktarın ve tamamen batırın.
Plakayı standart koşullar altında tutulan bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kültürün ikinci ve dördüncü günlerinde, kuyuda 10 mikrolitre bırakan ortamı çıkarın ve devam eden hücre ve doku canlılık koşullarını korumak için tedavi bileşikleriyle birlikte taze önceden ısıtılmış DMEM F-12 tam ortamı ekleyin. SCAD'lerin canlı görüntülenmesi için, bir mikrodalga fırında ısıtılarak bir cam şişede PBS'de 30 mililitre 2 ila% 3 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi hazırlayın.
Kaynattıktan sonra, şişeyi hemen aktarın ve sıvı agaroz çözeltisini 40 santigrat derecelik bir su banyosunda soğutun. Daha sonra, SCAD dokusunu fasya veya yara izi yukarı bakacak şekilde 35 milimetrelik bir kabın merkezine aktarın. Ardından, 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak 40 santigrat derece sıvı agarozu yavaşça dokuya dökerek SCAD'yi oda sıcaklığında gömün.
Agarose iki dakika içinde polimerize olur. Polimerizasyondan sonra, iki mililitre önceden ısıtılmış DMEM F-12 tam ortam ekleyin. Daha sonra, makalede açıklanan uygun inkübasyon sistemleriyle donatılmış bir konfokal veya çoklu foton mikroskobu kullanarak, sıfır gününden birinci güne kadar hızlandırılmış görüntüler elde edin.
Doku hasadı için, ortamı steril PBS ile değiştirerek dokuları ilgili zaman noktalarında yıkayın. Steril forseps kullanarak, dokuları gece boyunca dört santigrat derecede sabitlemek için her SCAD'yi 500 mikrolitre% 2 paraformaldehit içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ertesi gün, metin yazısında açıklandığı gibi iki veya üç boyutlu immünofloresan boyamaya geçmeden önce dokuları PBS ile üç kez yıkayın.
SCAD'lerin sıfır ve beşinci günlerdeki temsili tam montajlı parlak alan görüntüleri burada gösterilmektedir. Masson'un dikey doku kesitlerini trikrom boyaması, sıfır ve beş günlerinde skar çekirdeğinde doku skarlaşması, doku kasılması ve hücre dışı matriks birikiminin imzalarını ortaya koymaktadır. SCAD'lerin sıfır ve beş günlerinde immünofloresan boyaması gösterilmiştir.
Erken ve geç evre skardan, kökleşmiş pozitif fibroblast yeşil ve kökleşmiş negatif fibroblast kırmızı renkte gösterilir. Üç boyutlu görüntüleme için, dokular agaroz çözeltisine gömüldü ve PBSGT ile kaplandı. Temsili görüntüler, N-kadherin proteininin beş günlük SCAD'nin skar bölgesinde özel lokalizasyonunu göstermektedir.
Bir inkübasyon odası ile donatılmış üç boyutlu hızlandırılmış görüntüleme kurulumu, fibroblast sürülerinin ilk 12 saat boyunca veya skar gelişiminin erken aşamalarında ilerlemesinin erken olaylarını gösterdi. Bireysel fibroblastların skar gelişimi üzerindeki tek hücreli izlenen hücresel yörüngelerinin grafiksel gösterimi burada sunulmuştur. SCAD dokusunu kuyu plakasının içine baş aşağı yerleştirmek çok önemlidir, böylece fasyanın yukarı bakması sağlanır.
Bunun yapılmaması, geçiş modellerinde kaçınılmaz değişikliklere neden olur. Bu prosedür, kimyasal modülatörler, nötralize edici antikorlar veya viral yöntemler kullanarak tedaviler veya kültür için dermal tabakaların incelenmesine izin verir. Bu, çeşitli tıbbi ortamlarda patolojik fibrotik yanıtların değerlendirilmesinde yardımcı olur.
Konneksin-43 ve N-kadherinin ekspresyonunu, yaralama üzerine fasya mobilizasyonunda rol oynayan anahtar moleküller olarak gösterdik. SCAD metodolojisi, skarlaşmayı ve fibrozu azaltmak için yeni terapötik stratejilerin tanımlanmasına izin verir.
