Bu model, kritik klinik öncesi aşamalardaki araştırmacıların yeni formülasyonların antimikrobiyal etkinliğini daha doğru bir şekilde belirlemelerini sağlayacak ve araştırmacılara ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrol sağlayacaktır. Bu model, temsili bir yara ortamında hızlı tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Amaç için yetiştirilmiş hayvanlara olan ihtiyacı azaltır ve yara enfeksiyonları için topikal antimikrobiyallerin kliniğe daha hızlı çevrilmesini kolaylaştırır.
Başlıca zorluklar kontaminasyon ve el becerisidir. Sıkı bir aseptik teknik ve doku işleme konusunda sabır esastır; Bu yöntemin başarısı için hassas ve amaçlı flep çıkarılması gereklidir. Forsepslerin dezenfeksiyonu ile başlayın, bir saat boyunca 200 santigrat derecede kuru ısı sterilizasyonuna maruz bırakın.
Tüm cam eşyaları kullanmadan önce 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Örnek alana yaklaşık 100 mililitre 200 PPM klor dioksit çözeltisi dökerek lambanın alın bölümünü dezenfekte edin. Alın bölümünü elektrikli makaslar kullanarak tıraş edin, ardından 200 mililitre 200 PPM klor dioksit çözeltisi ile yıkayın.
Alanı etanol ve mavi bir rulo kullanarak silin ve numune alanını epilasyon kremi ile örtün. 35 dakika sonra, bir kazıma aleti kullanarak epilasyon kremini nazikçe kazıyın ve numune alanını değerlendirin. Önemli miktarda saç kalırsa epilasyon işlemini tekrarlayın.
Temiz numune alanını 200 mililitre klor dioksit çözeltisi ve ardından etanol ve mavi bir rulo ile durulayın. Hazırlanan alandan sekiz milimetrelik bir cilt örneğini kesmek için steril sekiz milimetrelik bir biyopsi punch kullanın. Daha sonra steril forseps ve 15 numaralı bıçaklı neşter kullanarak numuneyi çıkarın ve tüm kutanöz yağların alındığından emin olun.
Numuneleri steril PBS ile doldurulmuş 0,5 litrelik steril bir kavanoza yerleştirin. Daha sonra bunları 50 mililitre 200 PPM klor dioksit çözeltisi ile doldurulmuş steril 50 mililitrelik tüplere aktarın. Tüpü iki kez ters çevirin ve 30 dakika sterilize etmeye bırakın.
Numuneleri 40 mililitre steril PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. PBS yıkamasından sonra, her cilt örneğini 24 delikli bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin. Önceden ısıtılmış ortamın 350 mikrolitresini bir kuyucukta eklerken, numuneyi hava-sıvı arayüzünde tutun.
Kuluçka plakasını nemlendirilmiş bir doku inkübatörüne 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede yerleştirmeden önce 24 kuyucuklu plakaları gaz geçirgen bir plaka contası ile kapatın. Kuluçkadan sonra, kültür ortamını çıkarın ve numuneleri 500 mikrolitre steril PBS'de durulayın. Artık antibiyotikleri, 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede antibiyotiksiz ortamlarla tedavi ederek numuneden çıkarın.
Antibiyotik içermeyen ortamda bulanıklık veya mantar enfeksiyonu gelişirse, numuneyi atın. Daha sonra, 10 mililitre steril Triptik Soya Suyu ile 50 mililitrelik bir tüp hazırlayın. Daha sonra birkaç Staphylococcus aureus kolonisini taze bir agar S.aureus plakasından et suyuna aktarın ve tüpü 18 saat boyunca 37 santigrat derece ve 150 RPM'de inkübe edin.
Tüpleri üç dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre steril PBS'de yeniden askıya alın. Steril PBS kullanarak inokülumu 600 nanometre dalga boylarında 0.6 optik yoğunluğa ayarlamadan önce PBS yıkamasını iki kez tekrarlayın. İnokulum yükünü manuel uygulanabilir bir plaka sayımı ile onaylayın.
Cilt örneğini enfekte etmek için, 400 mikrolitre önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen ortam içeren taze bir 24 delikli plaka hazırlayın ve steril forseps kullanarak 24 kuyucuklu ekleri ekleyin. Ortamı cilt örneklerinden çıkarın. 500 mikrolitre steril PBS ile yıkayın ve yıkamayı çıkarın.
Numuneyi yavaşça kuyucuğun dibine tutmak için steril forseps kullanın. Cilt örneğini bir ila iki milimetrelik kaba bir derinliğe delmek ve merkezi bir yara kapağı yapmak için dört milimetrelik bir punch biyopsisi kullanın. Daha sonra yara kapağının üst tabakasını çıkarmak için 15 numaralı bıçaklı neşter ve steril dişli Allis doku forseps kullanın.
Tüm numuneler yaralandıktan sonra, steril forseps kullanarak bunları 24 kuyu ekine aktarın. Pipet, nemlendirilmiş bir doku inkübatöründe 37 santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatmadan önce yara yatağına 15 mikrolitre bakteri inokülumu. Daha uzun inkübasyon süreleri için, ortamı çıkarın, her 24 saatte bir taze ortamla değiştirin ve plakaları aynı koşullar altında inkübe edin.
Bakteri yükünü belirlemek için, ortamı kuyucukların dibinden çıkarın. Steril forseps kullanarak, her numuneyi bir mililitre steril PBS ile doldurulmuş ayrı bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, numune yüzeyini ince uçlu bir homojenizatör ile homojenize ederek bakterileri yara yatağının yüzeyinden ayırın.
Yara yatağının homojenizatörün ucu ile doğrudan temas halinde olduğundan emin olun. Tüm numuneler işlendikten sonra, 20 mikrolitre homojenatı 180 mikrolitre steril PBS içeren 96 delikli bir plakanın ilgili kuyucuğuna aktarmadan önce her numuneyi vorteksleyin. Her numune homojenatını 1 kat 10'dan negatif 7'ye kadar seri olarak seyreltin ve seyreltilmiş homojenatın 10 mikrolitresini üçlü olarak bir Triptik Soya Agar plakasına pipetle seyreltin.
Triptik Soya Agar plakasını 37 santigrat derecede inkübe edin ve 18 saat sonra, her örnek için koloni oluşturan birimleri veya CFU'yu belirlemek için koloni sayısını sayın. Farklı süreler boyunca farklı tedaviler kullanılarak uygun bir cilt sterilizasyon rejimi tanımlandı. Doku bütünlüğü histoloji ile izlendi, ardından tedaviden hemen sonra hematoksilin ve eozin ile boyandı.
Klor dioksit ile 30 dakikalık bir tedavi, doku bütünlüğünü korurken cilt dokusunu tekrar sterilize ederek en etkili tedaviydi. Yara yatağında beyaz bir film, enfeksiyondan 48 saat sonra dokuda belirgindi. Çizik modeli 24 saat sonra daha yüksek bir ortalama CFU sayısına sahip olmasına rağmen, flep çıkarma yaralama tekniği daha tutarlı sonuçlar verdi.
48 saat sonra, yaralı dokudan inoküluma kıyasla yaklaşık 100 kat daha fazla bakteriyel CFU geri kazanıldı ve bu da başarılı bir enfeksiyonu gösterdi. Enfekte olmuş dokunun gram lekeli histoloji bölümleri, enfekte olmamış doku bölümlerinde bulunmayan yara yatağında S.aureus hücrelerinin varlığını gösterdi. Bu prosedürü takiben, doku yanıtını incelemek için immünohistokimya, bakteriyel lokalizasyonu görselleştirmek için modifiye gram boyası ve antimikrobiyal etkinliği test etmek için antimikrobiyal maruziyetten sonra uygulanabilir plaka sayıları gerçekleştirilebilir.
Yeni antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılar için bu model, kurşun optimizasyonunun daha fazla kontrolünü sağlayacak, pahalı ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş hayvan denemelerine olan bağımlılığı azaltacak ve antimikrobiyallerin kliniğe hızlı bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.
