このモデルにより、重要な前臨床段階にある研究者は、新規製剤の抗菌効果をより正確に判断でき、研究者は医薬品の設計と製剤をより細かく制御できるようになります。このモデルは、代表的な創傷環境で迅速に再現性のある結果を可能にします。目的繁殖動物の必要性を減らし、創傷感染症のための局所抗菌薬の診療所への迅速な翻訳を促進します。
主な課題は汚染と器用さです。厳密な無菌技術と組織処理の忍耐が不可欠であり、この方法の成功には正確で意図的なフラップ除去が必要です。鉗子を摂氏200度で1時間乾熱滅菌にさらすことによって鉗子の消毒から始めます。
使用前に、すべてのガラス製品を摂氏121度で15分間オートクレーブします。ランプの額部分を消毒しますamp サンプル領域に約100ミリリットルの200PPM二酸化塩素溶液を注ぎます。電気バリカンを使用して額部分を剃り、続いて200ミリリットルの200PPM二酸化塩素溶液で洗浄します。
エタノールと青いロールを使用して領域を拭き、サンプル領域を脱毛クリームで覆います。35分後、掻き取りツールを使用して脱毛クリームをそっとこすり落とし、サンプル領域を評価します。かなりの量の髪が残っている場合は、脱毛プロセスを繰り返します。
きれいなサンプル領域を200ミリリットルの二酸化塩素溶液とそれに続くエタノールと青いロールですすいでください。滅菌8ミリメートル生検パンチを使用して、準備された領域から8ミリメートルの皮膚サンプルを切り取ります。次に、滅菌鉗子と15番のブレードメスを使用してサンプルを取り除き、すべての皮膚脂肪が除去されていることを確認します。
サンプルを滅菌PBSで満たされた滅菌0.5リットルの瓶に入れます。次に、それらを50ミリリットルの200 PPM二酸化塩素溶液で満たされた滅菌50ミリリットルのチューブに移します。チューブを2回反転させ、30分間滅菌します。
サンプルを40ミリリットルの滅菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに移します。PBS洗浄後、各皮膚サンプルを24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。サンプルを気液界面に維持しながら、350マイクロリットルの予熱した培地をウェルに加えます。
24ウェルプレートを気体透過性プレートシールで密封してから、5%二酸化炭素、37°Cの加湿組織インキュベーターに24時間インキュベーションします。インキュベーション後、培養液を取り出し、500マイクロリットルの滅菌PBSでサンプルをすすぎます。抗生物質を含まない培地で5%二酸化炭素、摂氏37度で24時間処理することにより、サンプルから残留抗生物質を除去します。
抗生物質を含まない培地で濁りや真菌感染症が発生した場合は、サンプルを廃棄してください。次に、10ミリリットルの滅菌トリプシン大豆スープを入れた50ミリリットルのチューブを準備します。次に、黄色ブドウ球菌のコロニーをいくつか黄色ブドウ球菌の新鮮な寒天プレートからブロスに移し、チューブを摂氏37度、150 RPMで18時間インキュベートします。
チューブを4, 000 Gで3分間遠心分離した後、上清を取り除き、細胞ペレットを10ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。滅菌PBSを使用して接種材料を600ナノメートルの波長で0.6光学密度に調整する前に、PBS洗浄を2回繰り返します。手動で実行可能なプレートカウントで接種材料の負荷を確認します。
皮膚サンプルを感染させるには、400マイクロリットルの予熱した抗生物質を含まない培地を含む新しい24ウェルプレートを準備し、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートを追加します。皮膚サンプルから培地を除去します。500マイクロリットルの滅菌PBSでそれらを洗浄し、洗浄液を取り除きます。
滅菌鉗子を使用して、サンプルをウェルの底にそっと保持します。4ミリメートルのパンチ生検を使用して、皮膚サンプルを1〜2ミリメートルの大まかな深さまで突き刺し、中央の創傷フラップを作成します。次に、15番のブレードメスと滅菌歯のアリス組織鉗子を使用して、創傷フラップの最上層を取り除きます。
すべてのサンプルが負傷したら、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートに移します。加湿組織インキュベーター内で摂氏37度で24時間インキュベートする前に、15マイクロリットルの細菌接種材料を創傷床にピペットで入れます。インキュベーション期間を長くする場合は、培地を取り出し、24時間ごとに新しい培地と交換し、同じ条件下でプレートをインキュベートします。
細菌負荷を決定するには、ウェルの底から培地を取り除きます。そして滅菌鉗子を使用して、各サンプルを1ミリリットルの滅菌PBSで満たされた別々の50ミリリットルのチューブに移します。次に、先端の細かいホモジナイザーでサンプル表面を均質化することにより、創傷床の表面から細菌を剥離します。
創傷床がホモジナイザーの先端に直接接触していることを確認してください。すべてのサンプルが処理されたら、各サンプルをボルテックスしてから、20マイクロリットルのホモジネートを180マイクロリットルの滅菌PBSを含む96ウェルプレートの対応するウェルに移します。各サンプルホモジネートを10倍から負7に段階希釈し、希釈したホモジネート10マイクロリットルをトリプティック大豆寒天プレート上に3連でピペットで入れます。
トリプシン大豆寒天プレートを摂氏37度でインキュベートし、18時間後に、コロニー数をカウントし、各サンプルのコロニー形成単位またはCFUを決定した。適切な皮膚滅菌レジメンが、さまざまな期間のさまざまな治療を使用して特定されました。.組織の完全性を組織学によってモニターし、続いて治療直後にヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
二酸化塩素による30分間の治療が最も効果的な治療法であり、組織の完全性を維持しながら皮膚組織を再現可能な滅菌を行いました。創傷床の白いフィルムは、感染後48時間で組織に明らかでした。スクラッチモデルは24時間後にCFUの平均数が多くなりましたが、フラップ除去創傷技術はより一貫した結果を生み出しました。
48時間後、接種材料と比較して約100倍多くの細菌CFUが創傷組織から回収され、感染が成功したことを示しています。感染組織のグラム染色された組織学切片は、創傷床に黄色ブドウ球菌細胞が存在することを示し、非感染組織の切片には存在しなかった。この手順に続いて、免疫組織化学を実行して組織反応を研究し、グラム染色を修正して細菌の局在を視覚化し、抗菌曝露後の生菌プレート数を実行して抗菌効果をテストできます。
新しい抗菌薬を開発する研究者にとって、このモデルは鉛の最適化をより細かく制御し、高価で厳しく規制された動物試験への依存を減らし、抗菌薬の臨床への迅速な翻訳を可能にします。
