Stabil floresan mitokondrili ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücreleri, farklı uyaranların in vitro mitokondriyal yapı üzerindeki etkisini incelemek için harika bir araçtır. Bu makalede açıklanan yöntem, çok sayıda glomerüler endotel hücresi vermektedir. Bir GEC üzerinde küçük molekülleri test ederek, GEC'lerin etkilendiği diyabetik böbrek hastalığı için monoterapi taraması yapabiliriz.
Açıklanan yöntemin gerçekleştirilmesi kolaydır ve belirli bir ekipman gerektirmez. Bununla birlikte, açıklanan adımları takip etmek ve kontaminasyonu önlemek için ekipmanı sterilize etmek önemlidir. Başlamak için, böbrek glomerüler hücrelerini izole etmek için gereken perfüzyon ve izolasyon malzemelerini bir çalışma alanına yerleştirin.
Taze hazırlanmış Hanks'Dengeli Tuz Çözeltisini veya HBSS'yi 0,2 mikronluk bir filtreyle filtreleyin ve kontaminasyonu önlemek için kaputun altında tutun. Ardından, 200 mikrolitre manyetik boncuğu 20 mililitre HBSS ile karıştırın. RPMI'yı% 10 FCS ve endotel hücre kültürü ortamı ile 37 santigrat derecede bir su banyosunda önceden ısıtın.
Daha sonra, altı delikli bir plakanın iki kuyuğunu oda sıcaklığında 45 dakika boyunca mililitre kollajen IV başına iki mililitre 10 mikrogram ile ön kaplayın. Kollajeni seyreltmek için kullanılan asetik asidi çıkarmak için plakayı PBS ile iki kez yıkayın. Kaplanmış plakaları hemen kullanın veya dört haftaya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.
Cerrahi aletleri ve çalışma alanını %70 etanol ile temizleyin. Daha sonra, cerrahi aletleri 30 dakika boyunca otoklav yapın. Anestezi uygulanan bir farenin karnını açtıktan sonra, sol ventriküle bir kelebek iğnesi yerleştirin.
Kan dolaşımını genişletmek için 100 mikrolitre boncuk çözeltisi enjekte etmek için, 19 gauge iğne ile böbreklerin altındaki inferior vena kavayı dikkatlice kırın ve boncuk çözeltisinin perfüzyonuna devam edin. Daha sonra, yağ dokusunu cımbızla yavaşça çıkarın, her iki böbreği de ince cerrahi makas C ile tüketin ve buz üzerinde bir mililitre HBSS içeren bir tabağa koyun. Böbreği steril bir neşterle bir milimetrelik küçük parçalara ayırın.
Kıyılmış böbreği, yatay bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe eğerek 37 santigrat derecede 35 dakika boyunca bir milimetre taze hazırlanmış kollajenaz tip II ile inkübe edin. Sindirimden sonra, kollajenazı nötralize etmek için% 10 FBS ile dört mililitre RPMI ekleyin. Sindirilen dokuyu steril bir 100 mikron hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün.
Sindirilen dokuyu süzgecin üzerine karıştırmak için steril 1,5 mililitrelik bir tüpün tabanını kullanın ve glomerüllerin geçmesine izin verin. Hücre süzgecini 15 mililitre HBSS ile durulayın. Ardından, akışı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 XG'de santrifüj edin.
Bu aşamada, tüp üç katman içerir. Üst tabaka tübüller gibi daha küçük yapılar içerir, orta tabaka glomerüllü boncuklardır ve alt tabaka döküntü içerir. Süpernatant ve üst beyaz tabakayı dikkatlice aspire edin.
Daha sonra, glomerülleri ve kalıntıları taşıyan boncukları içeren peleti 1.5 mililitre HBSS'de yeniden askıya alın ve iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü manyetik bir yoğunlaştırıcıya yerleştirin ve boncukları bir mililitre HBSS ile iki kez yıkamadan önce süpernatantı aspire edin. Bir slaytın üzerine 20 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin.
Ardından, glomerüllerin varlığı için slaytı mikroskop altında gözlemleyin. Daha sonra, peleti bir endotel hücresi büyüme ortamında yeniden askıya alın ve süspansiyonu iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Her üç mililitre ortam için bir mikrolitre interferon gama ekleyin ve hücreleri 33 santigrat derecede inkübasyon için altı delikli bir plakaya yerleştirin.
Üç günlük kültürden sonra, bir mililitrelik ortamı dikkatlice taze bir ortamla değiştirin. Bu aşamada, hücreler glomerüler hücrelerin bir karışımı ile heterojendir. Yedi gün sonra, ortamın hücrelerin çoğalmasını başlatmak için interferon gama ile desteklenmiş iki mililitre taze endotel hücresi büyüme ortamı ile değiştirin.
10 gün sonra, hücreler% 80 akıcılığa ulaştığında, tripsin kullanarak onları geçirin ve kollajen IV ile kaplı bir T-25 şişesine aktarın.21 günlük kültürden sonra, hücreleri bir T-75 şişesine aktarın. Bir T-75 şişesine üç mililitre% 0.25 tripsin ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tripsini üç mililitre endotel büyüme ortamı ile nötralize edin ve süspansiyonu beş dakika boyunca 200 XG'de santrifüjleme için 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Süpernatantı aspire edin ve hücreleri% 1 BSA,% 1 milimolar EDTA,% 1 penisilin / streptomisin içeren bir mililitre PBS içinde yıkayın. Yine 200 mikrolitre CD31 antikor kaplı boncuk ve 800 mikrolitre PBS içinde peleti santrifüj edip yeniden askıya alın. Hücreleri 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede sürekli sallama ve% 5 karbondioksit ile inkübe edin.
Daha sonra, tüpü manyetik yoğunlaştırıcıya yerleştirin ve hücreleri BSA, EDTA ve penisilin / streptomisin içeren PBS ile dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri interferon gama ile desteklenmiş üç mililitre endotel büyüme ortamında yeniden askıya alın. Kollajen IV'te kuyu başına 1,5 mililitre hücre plakası, altı kuyucuklu bir plaka üzerinde ve 33 santigrat derecede izin verilen koşullar altında kültür ile kaplanır.
Dört gün sonra, ortamın 750 mikrolitresini, interferon gama ile desteklenmiş taze bir endotel büyüme ortamı ile değiştirin. 10 ila 14 günlük kültürden sonra, 488 nanometre filtreli bir epifloresan mikroskobu kullanarak, floresan mitokondri eksprese eden koloniler olan CD31 pozitif glomerüler endotel hücresi veya GEC'lerin büyümesini gözlemleyin. 21 gün sonra veya hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, bunları bir T-25 şişesine aktarın.
Kültürü% 10 FCS içeren bir RPMI büyüme ortamı ile koruyun. Alternatif olarak, hücreler kriyoprezerve edilebilir. Daha önce gösterildiği gibi tripsin kullanan geçiş hücreleri.
Daha sonra, hücreleri santrifüj edin ve peleti üç mililitre dondurucu ortamda yeniden askıya alın. Hücreleri kriyo tüplerinde alıkoyun ve sıvı azotta, buhar sıcaklığında saklayın. Bu protokol, glomerüler endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem tanımladı.
İzole glomerüllerden, hücreler üç günlük kültürden sonra yavaşça büyümeye başladı. Yedi gün sonra, hücreler heterojen göründü ve podositler, parietal, epitel ve mezangial hücreler gibi diğer glomerüler hücre tiplerini gösterdi. % 70 ila% 80 akıcılığa ulaştıktan sonra, diğer glomerüler hücreler pozitif bir endotel hücresi seçimi kullanılarak çıkarıldı.
MitoDendra2 GEC'ler CD31'i eksprese etti ve sinaptopodin negatif boyama ile gösterildiği gibi podosit belirteci için negatifti. Glukoz konsantrasyonunun mitokondri yapısı üzerindeki etkisi incelendi. Normal glikoz altındaki hücrelerde görülebilen uzamış mitokondri ile karşılaştırıldığında, belirgin sferoid şekilli mitokondri tarafından gözlendiği gibi, yüksek glikoz indüklenen mitokondri parçalanması veya fisyonu.
Ayrıca, tek bir canlı MitoDendra2 GEC'de seçilen bir mitokondri alt popülasyonunu fotodönüştürmek için 405 nanometrelik bir lazer kullanıldı. Normal ve yüksek glikoz konsantrasyonu ile tedavi edilen hücreler için seçilen alanda mitokondrinin yeşilden kırmızıya başarılı bir şekilde foto-anahtarlanması gösterilmiştir. Bu geçiş, MitoDendra2 GEC'lerdeki füzyon olaylarına tanık olmayı sağladı.
Normal glukoz altında, mitokondri matriks füzyonu nedeniyle sarı birleşmiş yeşil ve kırmızı floresan gözlendi. Buna karşılık, yüksek glikozla tedavi edilen GEC'lerde, mitokondri esas olarak parçalanmıştır. Hücreleri, küçük hacimli bir büyüme ortamına sahip altı delikli bir tabaktaki bir kuyucuğa yerleştirmek, hücrelerin yemeğe yapışmasına izin vermek için esastır.
İzole endotel hücreleri mitokondriyal fonksiyon ve yapısal çalışmalar yapmak için kullanılabilir. Floresan mitokondri özelliklerine sahip ölümsüzleştirilmiş endotel hücrelerinin kullanılması, ilaç keşfine giden yolu açacaktır. Küçük moleküller hücreler üzerinde test edilebilir ve mitokondri fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için canlı görüntüleme yapılır.
