Biz kritik yazının okuma, zaman atlamalı görüntüleme ile yardım için UNC en Mikroskop Hizmet Laboratuvarı, ve finansman desteği için NIH (hibe # R01HL061656) için Andrea Portbury teşekkür etmek istiyorum.

1. Antikor-konjuge boncuk hazırlayın <ol><li> Diseksiyon önce bir gün, üreticinin talimatlarına göre, uygun Dynabeads (sıçan yükseltilmiş bir antikor örneğin fare IgG Dynabeads, 4 x 10 8 boncuk / ml), seçilen antikor bir araya getirir. BD sıçan anti-CD31 antikoru (0.5 mg / ml, endotel hücreleri izole etmek için kullanılan) için 3 ul antikor, bir son 1.5 mg anti-CD31 antikoru konsantrasyonu ve / 1 x 10 7 boncuklar için, her 25 ul boncuk ilave edilir 25 ul tampon. </li><li> 4 ° C&#39;de boncuk ve gece antikor inkübe </li></ol> 2. Kollajen Plaka hazırlanması <ol><li> Sadece bir kollajen kaplı plaka aksine bir kollajen jel üzerinde büyüdüğü zaman izole hücreler daha hızlı tübüller oluştururlar. 6&#39;da tarif edildiği gibi bu nedenle, kollajen jel, diseksiyon gece önce yapılır. Bir doku kültürü kaputu buz üzerinde, aşağıdaki reaktifler (yeterli 19 kuyu için) birleştirmek: 206,4 ul steril H &lt;alt&gt; 2, O, 140.4 ul kollajen tip I (4.08 mg / ml), 38.4 ul 10x M199 ve 1.15 ul 5 M NaOH. </li><li> , 384-çukurlu bir doku kültür plakasının deliklerine içine bu kollajen jel Pipet 20 ul. 30 dakika boyunca 37 ° C doku kültürü inkübatöründe plaka koyun. </li><li> Her kuyuya 80 ul DMEM ekleyin ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe ° C Kültür ortamı çıkarın ve iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Son durulama sonra, iyi FBS / DMEM her 80 ul% 10 ekleyin ve 37 gece boyunca inkübe ° C İzole hücrelerin eklenmesinden önce, kültür ortamı çıkarın. </li></ol> 3. Vergi ve Kalp Digest <ol><li> Onaylanmış bir ötenazi tekniği kullanarak istenen embriyonik gün bir zamanlı hamile fare Euthanize. Tüm deneyler Chapel Hill&#39;deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. </li><li> Bir yatar pozisyonda fare ile, liberal önce% 70 etanol ile kadın ventral tarafı spreydiseksiyonu. Iç organların uzak alt karın cilt ve kas kaldırmak için forseps kullanarak, iç organları görselleştirmek için dişinin alt karın boşluğu açmak kesti. </li><li> Forseps ile serviks Holding, dikkatle forseps için kuyruk kesme ve karın boşluğundan uterin horn kaldırma başlar. Uterin boynuz kaldırırken, yerine boynuz tutan herhangi bir bağ dokusu kesip. Uterin boynuz eksize bitirmek için, rahim boynuz boşaltmak için yumurtalık ile rahim boynuzu kavşak kesti. </li><li> Soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve gerektiğinde durulama içeren bir Petri kabındaki uterin horn yerleştirin. Ekli embriyonik kesesi ortaya çıkarmak için orta hat üzerinden uterin horn açın kesin. </li><li> Embriyo kesme yanlışlıkla önlemek ve bir embriyo almak için plasentanın kavşakta bir embriyonik kese ve embriyo açın kesin. Soğuk PBS ile ikinci bir Petri tabağına yerleştirin embriyo. Buz rahim boynuz ile Petri kabı dönün. </li><li> Dgöğüs duvarı erişimi artırmak için embriyo ecapitate. Genotiplendirme gerekli ise, çıkarın ve buz üzerinde yerleştirilen bir Eppendorf tüp kaydetmek için kuyruk kesti. </li><li> Sırtında embriyo ile kalp ve akciğer görselleştirmek için göğüs duvarı açın kesti. Sonra, yavaşça yol göğüs duvarı yukarı çekin ve dışarı, kalp kesim önlemek için, kaburga alt kısmında yatay bir kesim tarafından izlenen bir ön ayakları yakın göğüs kafesinin sol tarafındaki dikey bir kesim, yapmak. Yaklaşık embriyonik gün 13.5 ile, göğüs duvarı görselleştirme yardım, şeffaftır. </li><li> Dikkatlice forseps kullanarak kalp kaldırın ve aşağıdaki damarları kesti. Daha sonra, kalp boşaltmak için büyük damarların üzerinde kesti. Akciğer damarları kesilmiş değilseniz, akciğer kalp ile kaldırılabilir. Gerekirse Böylece, akciğer gibi, yabancı dokuları çıkarın. </li><li> Ayırın ve ventriküllerden kulakçıklar ve büyük damarları atın. Makas kullanarak, küçük parçalar (yaklaşık 1 mm 3 &lt;içine ventrikül kıyma/&gt; Sup) ile yaklaşık 500 ul kolajenaz (steril PBS içinde 1 mg / ml) içinde bir yer. Tüm ventrikül kıyılmış ve kollajenaz yerleştirilmiştir kadar buz üzerinde örnekleri tutun. </li><li> Ventrikül ayrı bir Eppendorf tüp her kalp toplama, tüm embriyolardan eksize edilmiştir kadar önceki adımları tekrarlayın. Tüm embriyolar aynı genotip varsa, kalpleri tek bir Eppendorf tüp toplanmış olabilir. Tek bir seferde işlenen örneklerin sayısını izolasyonu için kullanılan mıknatıs dayalı sınırlı olabilir; DynaMag (123-21D) 16 Eppendorf tüpleri en fazla tutar Burada kullanılan. </li><li> 45 dakika süre ile sallanan ile 37 ° C de kıyılmış ventriküller yerleştirin. Her 15 dakika, hafifçe örnekleri çıkarın ve mekanik hücreleri ayırmak aşağı yukarı pipet ve. </li></ol> 4. Endotel Hücreleri İzolasyon <ol><li> Hücrelerin kalan kümeleri kaldırmak için filtre 70 mikron ile ventrikül-kollajenaz çözüm geçmek. </li><li> 10 dakika için 400 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Iskartasüpernatant, DMEM yaklaşık 200 ul% 10 FBS ile değiştirin, ve hücreleri ayırmak aşağı yukarı pipet ve. </li><li> Bir kez bir önceki adımı yineleyin. Ikinci% 10 FBS / DMEM yıkamadan sonra 10 dakika için 400 xg&#39;de hücreleri santrifüj. 50 ul% 10 FBS / DMEM hücrelerin tekrar. </li><li> Son santrifüjleme basamağı sırasında, boncuklar hazırlar. <ol><li> 1 dakika boyunca bir mıknatıs üzerinde antikoru ve boncuklar içeren Eppendorf tüpüne koyun. </li><li> Mıknatıs üzerinde yerinde borusu ile süpernatantı. Mıknatıstan tüp çıkarın ve yaklaşık 100 ul% 10 FBS / DMEM ekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin. Süpernatantı ve% 10 FBS / DMEM ile tekrar yıkayın. 3 yıkar toplam tekrarlayın. </li><li> Son yıkamadan sonra,% 10 FBS / DMEM-konjuge antikor boncuklar (numune başına 5 ul) tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol></li><li> Her bir hücre örneği için, antikor-konjuge boncuk 5 ul ekleyin. Sallanan gıda ile 4 ° C de boncuk hücre süspansiyonları yerleştirinr 30 dakika. </li><li> , Bir laminar akış başlığı içinde, 1 dakika için mıknatısla hücreleri ve antikor-konjuge boncuklar içeren Eppendorf tüpleri. Süpernatantı, mıknatıs gelen tüpleri çıkarın ve yaklaşık 100 ul% 10 FBS / DMEM ile yıkayın. 5 yıkama için tekrarlayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpleri süpernatantı ve mıknatıs tüpleri çıkarın. Yaklaşık 100 ul DMEM ekleyin. </li><li> 1 dakika için mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin, süpernatant kaldırmak ve mıknatıs gelen tüpleri çıkarın. 100-200 ul ekle% 0.25 tripsin-EDTA ile önceden ılıtılır. 37 ° C&#39;de numunelerin ve 5 dakika boyunca% 5 CO2. </li><li> 2 dakika için mıknatıs tüpler yerleştirin. Taze Eppendorf tüplerine hücre içeren süpernatant dikkatlice aktarın. 400 x g hızında 5 dakika santrifüjlenir. </li><li> Süpernatantı. Beklenen verim bağlı olarak, ya da 384-iyi muamele kültür çanak - 80-100 ul büyüme ortamı ve plaka 96 hücrelerin tekrar süspansiyon(E14.5-E16.5 embriyoların ventrikül yaklaşık 450-600 hücreleri). Endotel hücreleri için, (aşağıda tanımlandığı gibi) endotelyal büyüme kültür ortamı kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li><li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li><li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li><li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling.">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Primer embriyonik hücreler ile çalışma yeni deneyler geliştirme in vitro kritik adımda ele sağlar. Ancak, izolasyon prosedürü önemsiz değildir. Hücrelerin her türlü izole etmek için kritik adımlar hücreleri de onlar iyi yıkama adımları sırasında askıya alınır o zaman kollajenaz sindirim üzerine ayrılır ve olmasını sağlamak yer alıyor. Pipetleme mekanik diseksiyon ölçüde kolajenaz adımı sırasında hücrelerinin ayrılmasında yardımcı olur ve filtreleme adımı h?...

Ölümsüzleştirdi hücre hatları gelişi temel hücre biyolojisi 1 devrim yarattı. Hali hazırda mevcut olan hücre hatları organların geniş elde edilen ve bütün büyük hücre tipleri kapsamaktadır edilir. Ancak, kurulan hücre hatları bazı sınırlamalar var. Ölümsüzleşme işlemi belli özel kullanım ömrü ve çoğalma ile ilgili olarak, hücre davranışını değiştirir, aynı zamanda, örneğin 2 sitoskeletal proteinler gibi beklenmedik proteinlerin ifade etkileyebilir. Pek çok farklı hücre hatları kullanılabilir olsa da buna ek olarak, bütün bir organizma içinde tek bir hücre türü arasında anlamlı bir farklılık yoktur. Özellikle gösteri çeşitli davranışlarda endotel hücreleri arter veya ven ve akış ne tür geminin 3 mevcut onlar hat olmasına göre. Gelişimsel olarak daha acil, ancak, (bakınız, örneğin, t mevcut hücre hatlarının büyük çoğunluğu yetişkin dokusundan elde edilen olmasıdırATCC ile kullanılabilir o toplama). Bu yetişkin hücre hatları büyük olasılıkla embriyonik öncüleri dinamik yapısı özetlemek yok. Gelişimi sırasında gözlenen hızla değişen uzaysal gen ifade desenleri belirli bir gelişim aşamasında bir organı bir endotel hücre farklı bir gelişim aşamasında aynı organdan bir endotel hücre ile aynı şekilde davranır değil olabileceğini düşündürmektedir. Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri kullanılarak bir alternatif olarak, primer hücrelerde ilgilenilen belirli bir dokusundan izole edilebilir. Bu tekniğin avantajı ise, bu birincil hücrelerde bile belirli bir organ ya da belirli bir gelişme aşamasında bir organ parçası izole edilebilir. Ayrıca, bu birincil hücreler gen nakavt ve bu transfeksiyon verimi gibi başka sorunlar kaçınarak Knock-in vitro çalışma sağlayan, mevcut transgenik hayvanların çeşitli izole edilebilir. Beklendiği gibi, pek çokteknikleri özel hücre tipleri 4,5 izole etmek için nasıl ayrıntılı yayınlanmıştır. Genel olarak, bu teknikler, hücreler, etiketleme ilgilenilen belirli bir hücre tipi, tutmuş ve daha fazla analiz için bu hücrelerin izole edilmesi, ilgili bölgenin toplama içerir. Koroner endotel hücrelerinin erken embriyonik nüfus incelemek için, daha küçük bir organı ile kullanmak için daha önce yayınlanmış teknik 4. küçültülmüş. Bu ölçekli aşağı prosedürü ile, özel embriyonik aşamalarında embriyonik kalp koroner endotel hücreleri izole olabilir. Bu hücreler daha sonra bu geçiş analizleri gibi geleneksel endotel deneyleri, de kullanılabilir. Erken evredeki embriyonik hücre hatları daha yaygın hale gelinceye kadar, birincil hücreler ile çalışan bir çok değerli bir tekniktir.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

Hücre kültürü büyük ölçüde sayısız kültür koşulları altında hücrelerin tek tek nüfus değerlendirmek için yeteneğimizi geliştirdi. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve bunların kullanım kolaylığı için önemli avantajlar sunmasına rağmen, bu hücre hatları tüm potansiyel hücre tipleri için kullanılamaz. Özellikle transgenik fare ilgi belirli bir bölgesinden birincil hücreleri, izole ederek, daha nüanslı çalışmalar yapılabilir. Temel teknik organ veya ilgi kısmi organı (kalp ve kalbin belirli bir bölge gibi) diseksiyon ve tek hücrelere organ dissociating içerir. Bu hücreler daha sonra ilgi hücre türünü tanıyan bir antikor ile konjuge manyetik boncukları ile inkübe edilir. İlgi hücreleri daha sonra, taneciklerden hücreleri ayırmasıyla kısa bir tripsin ile inkübasyon sonucunda, bir mıknatısın kullanılması ile izole edilebilir. Bu izole edilmiş hücreler daha sonra kültüre ve benzeri gibi arzu edilen analiz edilebilir. Bu teknik, aslında yetişkin fare organ için tasarlanmıştırs ancak kolayca burada gösterdiği gibi, embriyonik organları ile kullanım için küçültülmüş olabilir. Bizim ilgi gelişmekte olan koroner damar olduğu için, biz özel embriyonik aşamalarında hücrelerin bu nüfus okumak istedim. Bu nedenle, orijinal protokole embriyonik ventriküllerin küçük boyutu ve bu gelişim aşamalarında endotel hücrelerinin potansiyeli düşük verim ile uyumlu olacak şekilde modifiye edilmesi gerekiyordu. Bu ölçekli aşağıya bir yaklaşım kullanarak, biz transgenik embriyonik ventriküler endotel hücreleri koroner pleksus yeniden değerlendirilmiştir.

CD31 tanıyan bir endotel spesifik antikor kullanarak, endotel hücreleri embriyonik (E) 13.5 (Şekil 1A), 18.5 (Şekiller 1B-1D) embriyoların ventriküller izole edilmiştir. Işlenmemiş bir kültür çanak yetişen, bu hücreler yuvarlak kalır ve yakın birleşik (Şekil 1A), bir Arnavut kaldırımı deseni oluşturacak. Sulandırmak kollajen de kuyu kat için kullanılmıştır ve endotel hücreler (Şekil 1B) bağlı olurken, onlar daha az zincir...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Görüntüleme.  University of North Carolina at Chapel Hill. Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Video: Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Embriyonik Kök Hücre Tedavi Hindlimb İskemi Türetilmiş Endotel Hücreleri

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...