Mitokondri nöronal sağlık için gereklidir. Birçok nörodejeneratif hastalıkta, aksonal mitokondri ilk acı çekenlerdir, ancak aksonal mitokondrileri bu kadar özel kılan şeyin ne olduğu açık değildir. Bu protokolde kullanılan odalardaki akışkan basınç gradyanı, mitokondri aksonlarının seçici tedavisine izin verir.
Bu, hücre gövdesi süreçlerini rahatsız etmeden bırakır ve aksonal biyolojiye odaklanmamızı sağlar. Burada membran potansiyeline duyarlı bir boya ile mitokondrinin depolarizasyonunu gösteriyoruz, ancak bu yöntem birçok farklı nöronal hücre tipine ve floresan okumalarına uygulanabilir. Başlamak için, kodlanmış altı kuyucuk plakasını steril bir davlumbaza yerleştirin ve steril çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın.
Plakaların üç ila beş dakika boyunca eğimli bir konumda kurumasını bekleyin. Fazla suyu vakum emme veya pipetleme ile temizleyin. Daha sonra mikroakışkan odayı% 80 etanol içine batırın.
Yine, mikroakışkan odayı eğimli bir konumda üç ila beş dakika kurutun ve fazla etanolün pipet ucuyla çıkarılmasını sağlayın. Tamamen kuruduğunda, mikroakışkan odayı kuyunun ve plakanın ortasına yerleştirin. Cam plakaya düzgün bir şekilde tutturulması için kenarlıklarındaki mikroakışkan haznesine ve ortasındaki mikro oluk bölümüne hafifçe dokunun.
İlk olarak, 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde istenen sayıda ayrışmış hipokampal nöron toplayın. Tüpü oda sıcaklığında dört dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatanı atın ve peleti sekiz mikrolitre B-27 nöro bazal ortamda yeniden askıya alın.
Daha sonra hücre çözeltisini mikroakışkan odanın kanal girişine dağıtın. Kanaldan akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun. Bir pipet kullanarak, kanalın çıkışında kalan hücre süspansiyonunu aspire edin.
Mikroakışkan odasını hücrelerle 15 ila 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra, üst aksonal kuyuyu 50 mikrolitre B-27 nörobazal medya ile doldurun ve akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun. Soma tarafındaki her bir kuyucuğu 150 mikrolitre B-27 nörobazal medya ile doldurun ve üstte bir gerilim kabarcığı oluşturun.
Ayrıca aksonal tarafın her iki kuyusunu da her biri 100 mikrolitre B-27 nörobazal medya ile doldurun. Yedi ila sekiz günlük in vitro kültürden sonra, aksonların mikro oluklardan büyüdüğünden ve aksonal bölmeye uzandığından emin olun. B-27 nörobazal ortamını çıkararak ve hem aksonal hem de soma kanallarının üst kuyucuklarına 100 mikrolitre önceden ısıtılmış görüntüleme ortamı ekleyerek cihazı yıkayın.
Ortamın alt kuyucuklara akmasına izin verin. Ortamı alt kuyucuklardan ve kalan herhangi bir ortamı üst kuyucuklardan çıkarın ve yıkamanın sonunda kuyucukları boş bırakarak taze ortamla tekrarlayın. Daha sonra hem somatik hem de aksonal üst kuyucuklara 100 mikrolitre beş nanomolar TMRE seyreltme ekleyin.
Tüm kuyucuklarda eşit bir hacim olana kadar ortamın her iki bölmeden de akmasına izin verin. TMRE içeren ortamla doldurun. Somatik bölmede ilgilendiğiniz bir bölge seçin ve mikro oluklardan aksonal bölmeye kadar takip edin.
Somatik ve aksonal bölmelerde görüntülenen mikro olukların birbiriyle eşleştiğinden emin olun. Dosya adını değiştirdikten sonra, 561 nanometre uyarma ve 625 nanometre emisyon dalga boylarını kullanarak kırmızı floresan görüntüleri elde edin. Somatik tarafta bir gerilim kabarcığının varlığını kontrol ederek soma ve aksonal odalar arasında hacim farkı sağlayın.
Ardından, görüntüleme ortamını, kanalın içindeki ortam hariç, aksonal tarafın her iki kuyucuğundan çıkarın. Mitokondriyal depolarizasyonu indüklemek için, görüntüleme ortamında seyreltilmiş 160 mikrolitre 20 mikromolar antimisin A üst aksonal kuyuya ekleyin. Her iki aksonal kuyuda eşit hacim olana kadar kanaldan akmasına izin verin.
Mikro olukları tanımlayarak, temel alma sırasında olduğu gibi aynı konumların görüntülendiğinden emin olarak görüntülemeyi tekrarlayın. Bu protokolü kullanarak, birincil hipokampal nöronlar mikroakışkan cihazlarda yetiştirildi, ardından membrana duyarlı bir boya olan TMRE ile mitokondriyal boyama yapıldı. Mitokondrinin homojen boyanması, mikro olukların her iki tarafında gözlendi, ancak ortada gözlenmedi.
Aksonal tarafa antimisin A eklenmesi üzerine, somal mitokondri TMRE sinyalini korurken, floresan aksonal Mitokondriden kayboldu Cihazı monte etmeden önce kuyuda veya cihazda nem kalmadığından emin olun. Aksi takdirde, odalar kapatılmayacaktır. Bu yöntemi kullanarak, akson ve lokal fonksiyonlardaki mitokondriyal fonksiyon kaybının etkilerinin yanı sıra retrograd sinyalizasyon ve küresel hücre sağkalımı üzerindeki etkisini inceleyebiliriz.
Mitokondriyal biyogenezin uzun zamandır sadece hücre gövdesinde gerçekleştiği düşünülüyordu. Bu yöntem, aksonal mitokondri hasarının, PINK1 proteininin eksikliğinin lokal çevirisini gerektirdiğini ortaya koymamızı sağladı.
