We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS&#160;1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.

Tüm deneyler onaylı protokolleri takip ve araştırma hayvanların insancıl bakımı için kurumsal kurallarına göre yapılmıştır. Yenidoğan farenin dekapitasyon yoluyla kurban edilmiştir. Hücre Kültürü için mikroakışkan Cihazlar 1. Hazırlık <ol><li> Harris ve arkadaşları, 17-19 tarafından tarif edildiği gibi hipokampal nöronlar büyümesi için polidimetil siloksan (PDMS) mikroakışkan cihazlar hazırlayın. Aşağıda kargo haritalama protokole uyarlanmıştır bazı değişiklikler vardır. Not: mikroakışkan aygıtları da (Malzeme listesi) ticari olarak temin edilebilir, bir üretim tesisi, böylece erişim gerekli değildir. </li><li> Olanağına% 100 etanol ile üç kez su ve üç kez, ardından aseton ile üç kez yıkanarak No 1 ½ kapak bardak (24 x 40 mm) hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta su içinde saklayın lamelleri. Bu tedaviler lamelleri cel ekilmesin- ile etkileşebilir enkaz temiz olduğundan emin olun yardımcıls, kirlenme ve hayatta. NOT: Aseton ve etanol inhalasyon, yutma, yanıcı ve göz teması (irritan) cilt teması (tahriş edici), durumunda tehlikeli. Resmi yönetmeliklere göre imha ediniz. </li><li> Ne zaman, kullanmak mikroakışkan cihaz başına 60 mm hücre kültürü çanak bir cam kapak yerleştirin ve kuru hava kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kabini içinde 45 dakika boyunca ortaya izin vermek için hazır. </li><li> Cihazları ustaları dışarı kesilir ve zımbalar rezervleri oluşturmak için kesilmiş sonra (Şekil 1A, B), sterilizasyon için 45 dakika için bir UV lambası ile donatılmış bir biyogüvenlik kabini içinde mikroakışkan kanalları yan-up ile koyun. NOT: en fazla 2 saat süreyle UV tedavi altına cihazları bırakmak PDMS bütünlüğünü etkileyebilir. </li><li> Mikroakışkan kanallar aşağı bakacak şekilde 60 mm plastik hücre kültürü çanak içinde her cam kapak üzerine bir cihaz yerleştirerek cihazlarını monte. Üst o hafif bir basınç uygulayınCihazın F, kapak camın için cihazın bir daimi olmayan bir sızdırmazlık temin etmek üzere (mikrokanallar dokunmaktan kaçının). Bir kapak ile, her 60 mm hücre kültürü çanak örtün. </li><li> Bir mikropipet kullanılarak, suyun akmasına izin vererek, üst iki mikroakışkan rezervuar (Şekil 1A, 1 ve 2), hücre kültürü dereceli su eklemek suretiyle aygıtları hidrat. Mikropipet, suyu buharlaştırmak ve mikro-akışkan haznesi 1 (200 ul) ve 2 (100 ul) içinde 1 mg / ml poli-L-lisin ekleyin. Hacim diferansiyel mikro (Şekil 1A, B) içinden akması için poli-L-lisin sağlayacaktır. </li><li> 60 mm&#39;lik hücre kültür kapları içinde cihazları 37 ° C inkübatör içinde devrilmesine emin olmak için, bir 150 mm plastik hücre kültürü kabı içine cihazları içeren üç ila 60 mm hücre kültür kaplarına yerleştirin ve bir kapak ile yemek kapsamaktadır. % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N inkübe edin. Tipik olarak kanal% 90&#39;dan daha fazla cihaz başına kullanılabilir ve mutlakaherhangi bir hava kabarcığı ya da fiziksel tıkanma içermez. </li><li> Ertesi gün su ile poli-L-lisin yerine ve en az 1 saat boyunca kuluçka makinesi içinde cihazı bırakın. Bu yıkamanın üç kez tekrarlayın. Suyu çıkarmak ve her cihaza (2% B-27 takviyesi ve 500 ıLl glutamax içeren) Neurobasal-A besi ekleyin. % 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N bırakın. </li><li> Aşağıda tarif edildiği gibi bir sonraki gün, hipokampal hücreleri plaka. </li></ol> Mikroakışkan Cihazlar Fare Hipokampal İlköğretim Nöronlar 2. Kaplama Not: Yeni doğmuş farelerin kültürlenmiş hipokampal nöronlar hazırlanması daha önce Jüpiter 25 yayınlanmıştır. Aşağıda mikroakışkan cihazlarda levha fare hipokampal nöronlar için adapte edilmiştir bazı değişiklikler olduğunu ve Transfeksiyonlar için uygun olmuştur. <ol><li> Fare beyni diseksiyon, daha önceden sıcak Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal bovin serumu(FBS; antibiyotikler olmadan), A Karışımı (125 mg DL-sistein, 125 mg büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve fosfat tamponlu salin (PBS), 500 ml, D-glikoz 3,125 g, filtre, bir 0.22 um filtre ile steril edilmiş) bir 37 ° C su banyosu içinde: ve bir çözeltisi (50 DNase I&#39;inin mg ve 100 ml Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) filtresinde 1.2 M MgSO 4 çözeltisi, 0.5 mi, 0.22 um&#39;lik bir filtreden steril bir DNase) deoksiribonükleaz. <ol><li> % 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine önceden sıcak Neuro temelli-bir büyüme ortamı pH dengelenmesi için akmaktadır. </li></ol></li><li> Oluşturulan protokollerle 26 göre 1-3 gün eski yenidoğan farelerden hippocampi teşrih. Buz üzerinde (10 mM HEPES pH 7.4, 50 mM glükoz, 100 E / ml penisilin ve / ml streptomisin, 100 ug içeren HBSS), 10 mi diseksiyon tampon ihtiva eden bir 15 ml konik bir tüp içinde hipokampları tutun. 15 ml konik tüp başına 4 Hipokampuslardan kadar koyun. </li><li> Kalan protokol gerçekleştirmek steril koşullarda olduğunuBir biyogüvenlik kabini içinde s. </li><li> Mixture A, girdap 5 ml papain 45 birimleri seyreltin ve papain toz çözünene kadar 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. DNase I çözeltisi 1 ml ilave edilir. 0.22 mikron şırınga filtre ünitesi sayesinde karışımı süzün. </li><li> 15 ml konik tüp içeren Hipokampuslardan gelen Dikkatlice aspire HBSS &#39;. Ekleyin, 10 ml soğuk (4 ° C) HBSS hipokampi ve bunları tüpün dibe sağlar. Dikkatle 15 ml konik tüp dan HBSS aspire. </li><li> Ben 4 Hipokampuslardan kadar karıştırılır ve 37 ° C&#39;de 20-30 dakika süreyle inkübe 1 mi Papain / DNase ekleyin. Konik tüpü karışımı ile hippocampi yıkanmak için her 5 dakikada eğin. Alternatif olarak hafifçe çalkalama (~ 100 rpm) ile 37 ° C su banyosu çalkalayıcısına hipokampları yerleştirin. </li><li> Aspire Papain / I karıştırma ve% 10 FBS ihtiva eden, önceden ısıtılmış DMEM (37 ° C) hipokampi iki kez yıkayın, DNase. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, 2 Hipokampuslardan,% 10 FBS ihtiva eden, önceden ısıtılmış DMEM ml ve pipetleme el çiğnemek hipokampları ekleyukarı ve nöronlar ayırmak için 1 ml pipet kullanarak 10-12 kat ~ aşağı. </li><li> Bu non-ayrışmış nöronlar konik tüp altına yerleşmek için izin verecek gibi çiğnemek ~ 1 dakika dinlendiriniz. Tüpün alt kısmında yerleşmiş olan büyük doku transferi kaçınarak, yeni bir 15 ml konik tüp ayrışmış nöron içeren süpernatant aktarın. </li><li> 2 dakika süreyle 1000 xg&#39;de hücreleri Spin ve dikkatle hücre pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. Hafifçe pipetleme 80 ul Neuro temelli-bir büyüme ortamında süspansiyon hücreleri. </li><li> Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 &#39;orta çıkarın. Mikroakışkan rezervuar 1 hücrelerin 20 ul (~ 275.000) uygulayın ve onları dolaşmasını sağlar. 20 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör yerleştiriniz. </li><li> Hücreler, kapak camın yapışmış sağlamak için mikroskop altında bakın. Tüm depoları kapalı dön Neurobasal-A besi ekleyin. % 5 CO ile 37 ° C inkübatör hücreleri ile cihazını geri <sub&gt; 2. </li><li> Aygıtları her ~ (glutamax olmadan) Neurobasal-A içeren% 2 B-27 takviyesi ile 2-3 gün ve kapalı üst rezervuarlar önlemek için buharlaşma kontrol edin. Nöronlar sonra kaplama ~ microfluidic kanallardan 2-3 gün aksonları uzatmak başlar. Konu nöronlar kaplama sonra genellikle 7-10 gün transfeksiyona. </li></ol> Mikroakışkan Aygıt Yetiştirilen Hipokampal Nöronlar 3. Transfeksiyonu <ol><li> Cihaz başına, 30 ul, Neuro temelli-A 1.2 ul Lipofektamin 2000 bir karışımı ve 30 ul Neuro temelli-A içerisinde 0.5 ug floresan yük füzyon plazmidinin bir karışım oluşturmak ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. DNA karışımına Lipofektamin karışımı ilave edin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. DNA% 4 B-27 takviyesi içeren Neurobasal-A 60 ul ekleyin / Lipofektamin karıştırın ve tüp hafifçe karıştırın. </li><li> &#39;Mikroakışkan rezervuar 2 ve 2&#39;den tüm ortamları çıkarın ve dikkatli bir orta int dökülüp olmadan% 2 B-27 takviyesi içeren Neurobasal-A ile kuyu doldurmakdiğer bölmelere O. </li><li> Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 &#39;bulunan ortamı çıkarın. DNA&#39;nın 120 ul ekleyin / Lipofektamin mikroakışkan rezervuar 1 karıştırın ve akıtın. 3-4 saat için% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör cihazı dönün. </li><li> &#39;Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 tüm ortamları çıkarın ve 24 saat Neurobasal-A içeren% 2 B-27 takviyesi ile değiştirin (ya da hazır olana kadar görüntüye). Tipik olarak, mikro yoluyla büyümek 5-7 aksonlar yaklaşık hipokampus kültürlü hücrelerde 26 için yayınlanan verimliliği ile tutarlı% 1-3 transfeksiyon etkinliğini temsil eden koşullar altında transfekte. </li></ol> 4. &quot;Kargo Mapping&quot; Analizleri <ol><li> Kargo hareketinin Canlı Görüntüleme <ol><li> 37 ° C inkübatör ve CO 2 kontrol odası ile donatılmış bir ters Epifloresans ışık mikroskobu görüntüleme gerçekleştirmek. </li><li> Bir MICR yetiştirilen hipokampalinden ile lamel monte edinMikroskop sahneye ofluidic cihaz. Nöron ölümünü önlemek için, daha uzun bir süre, 1 saat boyunca mikroskopla örnekleri korumak için süratle çalışır. </li><li> Yüksek çözünürlüklü bir hedefi (100 X) kullanarak, mikroakışkan bölmelerin kanalları boyunca uzanan ve transfekte akson bulundu edildiği kanalların sayısını kaydetmek transfekte edilmiş hücrelerin aksonlar bulabilirsiniz. Bir el taksitli sayacı kullanarak kanal sayısını. <ol><li> Canlı hareket ve daha sonra ko analiz optimal kayıt için, çoğu kesecikler bu görüntüleme odak gerçekleştirilebilir, böylece kanaldan nispeten düz bir büyümeye aksonlar seçin. </li></ol></li><li> Bir tane 1 ml&#39;lik plastik bir transfer pipeti ile rezervuar 2 ve 2 &#39;den sıvı ortamı en iyi çıkarın. Kymographs üzerinde hareket yörüngeleri sabit görüntülerin ardından hizalamayı kolaylaştırmak için, görüntüleme (Şekil 1B, C) ​​sırasında görüş alanı ile mikrokanalların sağ kenarına hizalayın. </li><li> Yerleştiğinde kolaylaştırmakgörüntüleme sırasında örneklerin g, iki kişi ile canlı görüntüleme gerçekleştirmek. Canlı görüntüleme tek bir kişi tarafından gerçekleştirilen Alternatif olarak, eğer, sürüklenme düzeltme ile donatılmış bir mikroskop sistemi kullanın. </li><li> (Şekil 2 ve Malzeme Listesi efsanesi belirtilen YFP-PrP C görüntüleme için mikroskop özellikleri ve ayarları) time-lapse analiz edilen kargo taşıma dinamikleri özgü özellikleri ile görüntüleme canlı kargo hareketi başlatın. </li><li> Yeterli canlı hareketi verileri toplanmıştır sonra, bir kişi PBS içinde önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid hücreleri düzeltmek için 0,04 g / ml sükroz içeren &#39;rezervuarları 2 ve 2 doldurmak zorunda. Bu canlı görüntüleme odağı bozacak gibi, mikroakışkan cihaz dokunmaktan kaçının. Fiksatif ilave edilirken diğer kişinin odağı ayarlamak var. Hareketin acil durdurma gözlendiğinde sabitleme başarılı. Sonra 1 ve 1 &#39;rezervuar Fiksatif ekleyin. NOT: Geçici photobleakargo floresan ching da gözlenen olabilir, ancak motor proteinlerin IF boyama (bir sonraki adımı) tamamlandıktan sonra floresan devam. NOT: Paraformaldehyde cilt ile temasında, solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş edicidir. Resmi yönetmeliklere göre imha ediniz. </li></ol></li><li> IF ko analizi için motor proteinlerinin aktif boyanması Not: tek tek hareket eden yük ile bağlantılı motor proteinlerinin nispi seviyeleri (antikor lekeleme ile tespit edildiği üzere), nicelendirilmesi için, doğrulamak ve antikor-antijen bağlanma doymuş olduğundan emin olmak için antikorlar titre edilir. Bu, söz konusu protein, ya nakavt edilmiş olduğu nöronlar ya sersemleyen kullanılarak antikorun özgünlüğünü belirlemek suretiyle yapılır, ve gerçekleştirerek, antikor konsantrasyonları artan analizi. Negatif kontroller için, nöronların Primer antikor yokluğunda ikincil antikor ile boyandı. Daha detaylıAntikor doğrulama tanımı Encalada et al., 16, ve Szpankowski ve diğ., 20 bulunabilir. <ol><li> Mikroskop sahneden mikroakışkan cihaz yetiştirilen hipokampalinden ile lamel çıkarın. Mikrokanallardır canlı ve sabit görüntüleri eklemek için bozulmadan kalması gerekir gibi, lamel mikroakışkan cihazı çıkarmayın. Bir nemlilik bölmesi içinde, aşağıdaki adımları. </li><li> Mikrokanalların içine çözümlerin akışını sağlamak için, en az 30 ul &#39;, 2, ve 2&#39; rezervuar 1, 1 arasında bir tampon hacim farkı korumak. sonraki tüm basamaklarda. Örneğin, &#39;mikroakışkan rezervuar 1, 1, ve 70 ul ortam hacminin&#39; mikroakışkan rezervuar 2, 2 100 ul medya sesini ekleyin. </li><li> Mikroakışkan cihazın odalarından Fiksatif çıkarın ve PBS yıkar arasında 10 dakika bekledikten hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> % 0.1 Triton X-100, Dilu ekleyerek hücreleri geçirgenleştirmektüm haznelere, 5 dakika boyunca PBS içinde monte edilir. </li><li> Bütün barajlar çözüm çıkarın ve PBS ile yıkayın. Yıkamanın yıkamalar arasında 10 dakika bekledikten üç kez tekrarlayın. </li><li> Tüm haznelerden çözeltisini çıkarın ve PBS içinde% 10 normal eşek serumu ve% 3 proteaz serbest ve immünoglobulin G (IgG) içermeyen BSA ihtiva eden tampon bloke uygulanır ve oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 5 dk çökeltileri kaldırmak için 20,000 xg birincil antikor stok solüsyonu Spin. Bloke edici tampon içinde, uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir antikor. Antikor çözeltisi ile mikro-akışkan cihazdan bloklama tamponunu değiştirin. 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında ya da O / N C&#39;de 2 saat boyunca örnekleri inkübe edin. </li><li> Tüm haznelerden çözeltisi çıkarın ve yıkamalar arasında 10 dakika bekleme, üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> 5 dk çökeltileri kaldırmak için 20,000 xg ikincil antikor stok solüsyonu Spin. Bloke edici tampon içinde, uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir antikor. İkincil antikor solüsyonu PBS ile değiştirin. Kuluçkaya yatmakoda sıcaklığında 1 saat süre ile örnekler. </li><li> Tüm haznelerden çözeltisi çıkarın ve yıkamalar arasında 10 dakika bekleme, üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> Doğrudan rezervuara bağlayan kanalların açıklığı içine montaj ortamı pipetle 10-20 ul montaj orta ~ PBS ile değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat -, 20 dakika boyunca ortam kuru olarak monte olsun. </li><li> Boyama iki gün (en fazla bir hafta) olan ışıkla bilmek ışıktan korumalı 4 ° C&#39;de saklayın cihazlar ve görüntü aksonlar. </li><li> Boyama tamamlandıktan sonra, mikroskop sahneye mikroakışkan cihaz yetiştirilen hipokampalinden ile lamel monte edin. Adım 4.1.1-4.1.7 görüntülü transfekte akson bölgesini bulun. </li><li> Yüksek çözünürlüklü hedefi (örneğin, yüksek bir sayısal diyafram yağ veya su objektif) kullanılarak, kargo, motor 1, motor, 2: üç kanalın her biri için Z-yığın görüntüleri (300 nm adım) edinin. NOT: aksonlar genellikle mükemmel düz büyümek yok gibi Z-yığınlarının kazanılması önemlidirTüm floresan puncta Mikrokanallarda ve bu nedenle değil, aynı odak düzlemi vardır. </li></ol></li><li> Kargo Haritalama <ol><li> Görüntü analiz yazılımı kullanılarak yük hareketinin kymograph oluşturur. Rietdorf ve Seitz (EMBL) tarafından geliştirilen ImageJ eklentisi kymographs üretmek için tavsiye edilir (indirmek için bakınız Malzemeler Listesi). NOT: ImageJ Sağlık 27,28 National Institutes geliştirilen bir kamu alanı, Java tabanlı görüntü işleme programı (indirme Malzeme Listesi için bakınız). </li><li> (Malzemeler, tespitin noktası (Şekil 2A, B) kymograph yörüngeler konumu üzerine onları atma piyasada mevcut grafik programı kullanılarak elle (adım 4.2.14 oluşturulan) floresan kargo sabit görüntüleri hizalamak Liste). Elle ilk kymograph üzerine sabit kargo görüntüyü atma ve elle belirli bir yörünge karşılık kargo puncta seçerek hizalamakymograph. En iyi hizalama sonucu almak için, eşleştirilmiş kargo için en iyi odakta Z dilim kullanın. Çeşitli Z, dilim kullanılabilir. </li><li> XY koordinatları ve kurulmuş bir algoritma kullanarak her floresan puncta için yoğunluğu genlikleri temsil noktası yayılma işlevine 2D Gauss uyacak şekilde belirlemek, her Z-yığını içinde görüntü (adım 4.2.14 üretilen kargo motor 1 ve motor 2) için üç kanal 16,20,21 (Şekil 2D) her birinde her bir nokta kaynağı. NOT: Jaqaman, Danuser ve meslektaşları 21-23 tarafından geliştirilen Gauss uydurma algoritması içermektedir XY koordinatlarını, 16,20 geliştirilen &quot;Motor kolokalizasyon&quot; adında bir özel inşa MATLAB yazılım paketi, elde etmek. Kullanımı için yazılım paketi ve ayrıntılı talimatlar talep üzerine temin edilebilir. </li><li> Kymograph üzerinde mobil veya sabit bir yörünge üzerinde haritalanmıştır tek tek yük puncta her biri için, T seçmeko &quot;Motor kolokalizasyon&quot; programı sonuçlarından koordinatları ve yoğunluk aralığı (bu kargolar tek tek Şekil 2B&#39;de etiketli) xy. Farklı odak düzlemleri üzerinde bulunan daha fazla kargo Haritayı adım 4.2.14 edinilen birkaç Z-yığın görüntüleri) kullanın. </li><li> Bireysel XY benzeri Z dilim (Şekil 2B) &#39;de, motor kanalın her biri için elde edilen değerler ile eşlenmiş kargo için koordinatları Karşılaştırması. Belirleyin ve kargo 300 nm yarıçapı içinde XY motorlu koordinatlarını seçin. Yük ve aynı odak düzlemi içinde sinyal var motorlar için, 300 nm yarıçapında bulunan puncta belirlemek için &quot;Motor kolokalizasyon&quot; yazılım paketi kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+superfamily+proteins+and+the+mechanism+of+organelle+transport.">Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport.</a> Science. 279, 519-526 (1998).</li><li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+transport+along+microtubules.">Bidirectional transport along microtubules.</a> Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).</li><li>Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+transport+of+organelles:+unity+and+struggle+of+opposing+motors.">Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors.</a> Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).</li><li>Gross, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hither+and+yon:+a+review+of+bi-directional+microtubule-based+transport.">Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport.</a> Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).</li><li>Gross, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+and+regulation+of+molecular+motors+in+Xenopus+melanophores.">Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores.</a> J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).</li><li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+opposite-polarity+microtubule+motors.">Coordination of opposite-polarity microtubule motors.</a> J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo:+a+tug-of-war+or+coordinated+movement.">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Shubeita, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+between+dissimilar+teams+of+microtubule+motors+regulates+transport+and+fission+of+endosomes.">Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hendricks, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Coordination+via+a+Tug-of-War+Mechanism+Drives+Bidirectional+Vesicle+Transport.">Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport.</a> Current Biol. 20, 697-702 (2010).</li><li>Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+kinesin+and+dynein+assemblies+drive+the+axonal+transport+of+mammalian+prion+protein+vesicles.">Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles.</a> Cell. 144, 551-565 (2011).</li><li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-plasma+Bonding+of+PDMS+for+Inexpensive+Fabrication+of+Microfluidic+Devices.">Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).</li><li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+Microfluidic+Device+for+the+Compartmentalization+of+Neuron+Soma+and+Axons.">Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons.</a> J Vis. Exp. 7 (261), (2007).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles.">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+localization+II:+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking.">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li><li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution:+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement.">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats.">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan protokol canlı nöronların göreli türü ve ilgili motor proteinlerin miktarı ile bireysel floresan mikrotübül tabanlı hareket eden kargo parçacıkların hareketinin yönlülük korelasyon sağlar. Daha önce, aksonal veziküler yüklerin toplam motorlu kompozisyon biyokimyasal olarak arıtılan veziküllerin ve organellerin 9,15 heterojen toplumlarda denendi. Ancak, hücre içi kargo tek bir türü için karakterize motorlu kompozisyon, çünkü homojen vezik...

Hücre içi ulaşım çeşitli hücresel etki 1 Proteinlerin, membranlar, organeller ve sinyal moleküllerinin verilmesi için tüm hücre tiplerinde önemlidir. Nöronlar son derece eleştirel çeşitli aksonal microdomains onların uzun mesafe teslimat için gerekli yüklerin içi ulaşım bağlıdır uzun, polarize projeksiyonlar hücreleri uzmanlaşmıştır. Iki büyük moleküler motor proteinlerinin aileleri - - Bu taşıma kinesinlerin ve dyneins aracılık kargolara bağlanan ve sırasıyla ileriye ve retrograd yönlerde polarize mikrotübüllerinde boyunca izleyebilirsiniz. Geriye hareket esas olarak dinein aracılık ederken, ileriye doğrultuda hareket kinesin motorlarının büyük bir işlev olarak zengin etti kolaylaştınlır. Sonuç olarak, aksonal yüklerin ileriye taşıma kinesin&#39;in süperailesinin 1-5 çeşitli aile üyeleri tarafından aracılık olabilir. Bazı yüklerin her iki yönde, m ısrarla hareket olsaost kargolar çift yönlü taşımak ve nihai hedeflere 1,5-13 yolunda sık sık ters. Ayrıca, gösterilmiştir ki, Yükün aynı anda yön önlisans karşıt yüklerin düzenlenmiş hareketi ters kutupluluk motorlar 5-7 koordine olarak nasıl soru yükselterek motorlar. Birlikte, aksonal yüklerin taşınması motorlar ve bu da çeşitli adaptörleri ve düzenleyici bağlama ortakları 14 bağlıdır kendi özel biyokimyasal faaliyetleri, bileşimin düzenlenir uyumlu bir süreçtir. Sadakatle Belirli bir kargo için aksonal taşıma mekanizmasını tanımlamak ve bu ulaşım yatan düzenlenmesini ortaya çıkarmak için, onların canlı taşıma sırasında bireysel yüklerin ile ilişkili motor proteinlerin ve onların düzenleyici bağlama ortaklarından kompozisyonunu belirlemek için her şeyden önemlidir. Diğer yöntemler, örneğin biyokimyasal yaklaşımlar, ortalama mot tahminleri sağlamakya da saflaştırılmış heterojen vezikül popülasyonları üzerindeki kompozisyonlar, ancak bu tahminler türünü veya tek hareketli kesecikler ilişkili motorların miktarlarda ortaya çıkarmak değil. Aynı zamanda, in vitro olarak, önceden monte edilmiş mikrotübüller boyunca vezikül taşıma yeniden yapılandırılması tek vezikül seviyesinde 15 motorun bir tipinin miktarının ölçülmesi sağladı. Bununla birlikte, bu deneyler, doğrudan bu veziküllerin taşıma vasıfları olan motorlara miktarı korele olur ve hücre düzenleyici faktörler yokluğunda taşıma ölçülen değildi. Endojen olarak ölçüm (IF) verileri, motor proteinleri ifade, bağışıklık tek tek hareket veziküllerin motor bileşimi (tip ve motorlar göreceli miktarı) belirler ve nöronlarda aynı veziküllerin canlı taşınması için bu parametreleri ilişkilendirir, burada sunulan bir protokol 16. Bu yöntem IF-to-live kargo hareketi verilerinin hassas haritalama gerektirir. Bu growin ile gerçekleştirilmektedirmikroakışkan cihazlarda g hipokampal fare nöronları protokolleri 17-19 kurdu aşağıdakiler. Bu cihazlar, sabit ve canlı ışık mikroskobu modaliteleri akson ve tek hareketli yüklerin tanımlanması ve korelasyon (&quot;haritalama&quot;) (Şekil 1) için izin verir. Kültürlü nöronların, taşıma kymographs çizilir ayrıntılı hareket bilgilerini almak için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntülü floresan etiketli kargo proteinleri ile aktarılır. Görüntüleme sırasında, nöronlar paraformaldehit ile sabitlenmiştir ve daha sonra endojen motor proteinlerinin karşı antikor ile boyanmıştır. Sabit kargo ve motor görüntüleri hareketi 16 yörüngeleri canlı kargo onları &quot;map&quot; (colocalize) canlı hareket kymographs üzerine bindirilmiş. Motor proteinlerinin dernek ile yüklerin canlı hareketini korelasyon, kolokalizasyon &quot;Mo adlı bir özel yapılmış MATLAB yazılım paketi kullanılarak analiz edilirtor kolokalizasyon &quot;16,20. Floresan etiketli kargolar ve motorlar üst üste kısmen olabilir kırınım-sınırlı noktasal özellikleri oluşturmak. Puncta örtüşen konumunu gidermek için, yazılım ilk otomatik olarak hassas XY alt-piksel konumunu belirlemek için, bireysel floresan puncta temsil eden her bir nokta yayılım fonksiyonu Gauss fonksiyonları uyuyor koordine ve yoğunluğu 21-23 genliği. Motorlar ve yük pozisyonları Daha sonra ko 16,20 belirlemek için birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, daha doğrusu diğer yöntemlerle 24 ile karşılaştırıldığında floresan puncta arasındaki ko atar. Bu yöntemin gücü canlı hareketi yörüngeleri (örneğin, yön ise bu tespitin anda hareket edilmiştir) kyt edilmiş olan sabit hücrelerin tek tek yük motorlarda ko değerlendirmek için yeteneğidirorded. Bu yöntemle, kinesinler ve dyneins (PrP Cı -Hücresel) çift yönlü hareket eden ya da akson 16 sabit olarak kalan bir nöronal olarak zenginleştirilmiş yük, normal prion proteinini yapmak vesiküller eş zamanlı olarak ilişkilendirmek için bulunmuştur. Bu analiz kargo ile ilişkili iken anterograde (kinesin) ve retrograd (dinein) motorlar iki yönde veziküllerin hareket etmek veya sabit kalması amacıyla faaliyetlerini koordine edildiği PrP C vezikül hareketinin düzenlenmesi için bir çalışma modeli formülasyonunu izin . Bu yöntemin diğer bir gücü herhangi diğer ilgi protein (ler) ile birlikte, hemen hemen herhangi bir hücre tipi içinde hareket birçok floresan işaretli Yükün ko / ilişkiyi karakterize etmek için potansiyel, geniş uygulanabilmesidir. Bu nedenle, bir çok canlı / sabit bir ilişki potansiyel geçici protein yük etkileşimleri saptanması için izin verebilir, hareketli parçalardan etiketli birçok bireysel flüoresan istenen bir p fazla analiz edilebilirzaman dönemdedir. Geniş uygulanabilirliği ve bu yöntem hitap edebilecek sorular tipi göz önüne alındığında, bu protokol nöronlar veya diğer hücre tiplerinde bu eğitim kaçakçılığı ve ulaşım dahil olmak üzere hücre biyologlar geniş bir kitleye ilgi olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:579px;">Reagent and Equipment Name</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5899-20mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-MEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal-A Medium (1X)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum Free Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX I Supplement (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS (1X) (Hank&#8217;s Balanced Salt Solution)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning cellgro Water for Cell Culture&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT46000CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>19925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DL-cysteine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I grade II</td>
			<td>Roche Applied Sciences</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde Solution 16% EM Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50980487</td>
			<td>Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA fatty acid and IgG free</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2403-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover Glass 1 1/2. 24X40mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2980-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axis microfluidic device, 450 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon Eclipse TE2000-U&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coolsnap HQ camera&#160;</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm cell culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibodies Used:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Kinesin light chain, V-17</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-13362</td>
			<td>specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>sc-9115</td>
			<td>specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10042</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11057</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21447</td>
			<td>&#160;recommended dilution 1:200.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plugins and Macros</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&#160;http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ Kymoraph Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using "cargo mapping" analysis

Moleküler motorlar nöronların içindeki veziküler kargoları taşımak faaliyetlerini koordine hangi mekanizmaların anlaşılması tek kese düzeyde motor / kargo derneklerin kantitatif analizini gerektirir. Bu protokolün amacı, aynı yük ile ilgili motorların bileşim ve ilgili miktarları (&quot;harita&quot;) ilişkili olduğu canlı yük hareket konumunu ve yönünü kantitatif floresan mikroskobu kullanmaktır. &quot;Kargo haritalama&quot; canlı canlı hareket kaydı sırasında kimyasal sabitleme takip microfluidic cihazlar üzerinde kültüre akson hareket floresan etiketli yükün görüntüleme, ve motorlar karşı antikorlar ile aynı aksonal bölgelerin sonraki immünoflüoresans (IF) boyama oluşur. Yükün ve bunların ilişkili motorlar arasındaki kolokalizasyon alt-piksel pozisyonunu atayarak değerlendirilir kırınım-li uydurma Gauss fonksiyonları tarafından, motorlu ve kargo kanalları koordinatlarıBireysel floresan nokta kaynaklarını temsil eden kişilere sınırsız bir puan farkı fonksiyonları. Sabit kargo ve motor görüntüleri sonradan izlenen yörüngeleri onları &quot;harita&quot;, kargo hareket araziler için bindirilmiş. Veri canlı hücrelerde veziküler yüklerin taşınmasını hem kaydetmek ve bu aynı kesecikler ilişkili motorları belirlemek için IF Bu protokolün gücü canlı bir birleşimidir ve. Bu teknik, bu yöntemler tek hareketli yüklerin hakkında kompozisyonlar ortaya yok gibi, saflaştırılmış heterojen toplu vezikül nüfusun ortalama motorlu bileşimini belirlemek için biyokimyasal yöntemleri kullanmak önceki zorlukların üstesinden gelir. Ayrıca, bu protokol protein bileşimi ile tek tek hücre içi yapıların hareketini ilişkili diğer hücre tiplerinde başka nakil ve / veya değiş tokuş yollarına analizi için adapte edilebilir. Bu protokol sınırlamaları nedeniyle kültürlü düşük transfeksiyon verimliliği için nispeten düşük verimlilik vardırBirincil nöronlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir kısıtlı bir bakış alanı. Gelecekteki uygulamaları floresan etiketli yüklerin ifade nöronların sayısını artırmak için yöntemleri içerebilir.

Şekil 1 hipokampal nöronlar büyümek için kullanılan mikroakışkan cihazın bir bakış gösterir (Şekil 1A, B). Nöronlar kanalların uzunluğu aksonal bölmeye tüm yol geçen dendritik projeksiyonlar engellerken mikro büyüklüğü aksonal bölmesine hücre gövdeleri (soma) difüzyonunu önlemektedir rezervuar 1&#39;de plakalanır. Kültürde ~ 2-3 gün sonra, nöronlar aksonal bölmesine (Şekil 1B, C) ​​içine Mikrokanallarda karşısında aksonları u...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis at JoVE.com

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using &quot;Cargo Mapping&quot; Analysis

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

9.3K Görüntüleme.  The Scripps Research Institute. Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Video: Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a noninvasive brain monitoring tool in cognitive neuroscience as well as a diagnostic tool for epilepsy and sleep disorders in neurology. However, the underlying mechanism of EEG rhythm generation is still under the veil. Recently introduced polyimide-based microelectrode (PBM-array) for high resolution mouse EEG1 is one of the trials to answer the neurophysiological questions on EEG signals based on a rich genetic resource that the mouse model contains for the analysis of complex EEG generation process. This application of nanofabricated PBM-array to mouse skull is an efficient tool for collecting large-scale brain activity of transgenic mice and accommodates to identify the neural correlates to certain EEG rhythms in conjunction with behavior. However its ultra-thin thickness and bifurcated structure cause a trouble in handling and implantation of PBM-array. In the presented video, the preparation and surgery steps for the implantation of PBM-array on a mouse skull are described step by step. Handling and surgery tips to help researchers succeed in implantation are also provided.

In this article, we described the surgery procedure and handling tips for implantation of ultra-thin polyimide-based microelectrode array (PBM-array) on the mouse skull for acquisition of high-density encephalography (EEG) in a mouse model.

Poliimid-temelli Mikroelektrod kullanarak Serbestçe Hareketli Fare Yüksek yoğunluklu EEG Kayıtlar

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Nörobilim

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Screening of Axonal Degeneration in Carpal Tunnel Syndrome Using Ultrasonography and Nerve Conduction Studies

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current diagnostic and severity gradation system cannot clearly indicate its coexistence, resulting in&#160;confusion of appropriate treatment prescription. There are also constraints in conventional methods for&#160;differentiation as well. This study aims at introducing an innovative, efficient, and quick screening protocol to differentiate axonal degeneration associated with CTS, using ultrasound and nerve conduction studies (NCS). It starts by using NCS to perform orthodromic stimulation at the wrist, to obtain the sensory conduction of the median and the ulnar nerves respectively. Meanwhile, the motor conduction&#160;of the median nerve is collected by stimulating the palm, wrist, and elbow, followed by the stimulation of the ulnar nerve at the wrist,&#160;below and above the elbow. Then, an ultrasound assessment is performed, using a linear array transducer, with cross-sectional area (CSA) and perimeter (P) at the wrist and at the one-third distal forearm calipered. Ratios (R-CSA, R-P) and changes from wrist to one-third distal forearm (&#916;CSA and &#916;P) are calculated according to a standard format. Potential axonal degeneration coexisting in CTS will be screened according to the criteria of NCS and cut-off values of ultrasound measurements established in a previous study. In terms of its noninvasiveness, low cost, convenience, and efficiency, it is easy to apply ultrasound complimentarily in clinical practice to prescreen patients with potential coexisting axonal degeneration. Nevertheless, the ultrasonographic imaging cannot directly reflect axonal degeneration. It still relies on conventional but invasive methods&#160;such as electromyography (EMG) and biopsy&#160;for confirmation if needed.

Here we present a protocol using nerve conduction studies and ultrasound to screen potential axonal degeneration associated with carpal tunnel syndrome. The criteria for differentiation are established. Compared to conventional approaches, this method is noninvasive, convenient, and efficient, with an overall satisfactory accuracy, sensitivity, and specificity.

Ultrasonografi ve sinir iletim çalışmaları kullanarak karpal tünel sendromunda aksonal dejenerasyon ile taranması

Axonal degeneration, indicative of surgical decompression, may coexist in carpal tunnel syndrome (CTS) as the disease progresses. However, the current ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment called the Cajal body. However, sequences that direct snRNA localization into this subnuclear structure have not been known until recently. To determine sequences important for accumulation of snRNAs in Cajal bodies, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs followed by their localization inside cells. First, we prepared snRNA deletion mutants, synthesized DNA templates for in vitro transcription and transcribed snRNAs in the presence of UTP coupled with Alexa488. Labelled snRNAs were mixed with 70 kDa-Dextran conjugated with TRITC, and microinjected to the nucleus or the cytoplasm of human HeLa cells. Cells were incubated for 1 h and fixed and the Cajal body marker coilin was visualized by indirect immunofluorescence, while snRNAs and dextran, which serves as a marker of nuclear or cytoplasmic injection, were observed directly using a fluorescence microscope. This method allows for efficient and rapid testing of how various sequences influence RNA localization inside cells. Here, we show the importance of the Sm-binding sequence for efficient localization of snRNAs into the Cajal body.

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving various cellular compartments. Here, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs in order to monitor their transport inside the cell.

Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Rotasyonel İvmeye Dayalı Sıçanlarda Diffüz Aksonal Beyin Hasarıİn İndüksiyonu

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...

<meta charset="utf8"></head><body>Primer Hipokampal Nöronlardaki Proteinlerin Canlı Hücre Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Nörodejeneratif Hastalıklarda Patolojik Proteinlerin Aksonal Taşıma Üzerindeki Etkisini Anlamak

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.