We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dikkat: Bu protokolde kullanılan çeşitli parçaların kullanımında ve atarken aşırı önlemler alınmalıdır. Kullanmadan önce, kurumsal düzenlemeler ve iş sağlığı ve güvenliği uygulamaları yerel özellikle bir ağır metal ve radyoaktivite kaynağı ve kurşun nitrat hem uçucu ve son derece zehirli olan osmiyum tetroksit, uranil asetat, için, kurulmuş ve takip edilmelidir bir ağır metal zehir. Tiyokarbohidrazid (TCH) yanlış kullanılırsa, patlayıcı ve zehirli gazlar üretmek için ayrıştırmak. Birçok kurum bu reaktifler rutin kullanılmaktadır ve yardım sağlayabilir hangi bir EM çekirdek tesisine sahip olacak. Beyin Dokusu ve SBFSEM Görüntüleme 1. Hazırlık <ol><li> % 5 isoflura - 4 kullanarak - (4 aylık ~ 2) C57 siyah fare (C57BL / 6J suşu) genç uyutmakne kurumsal yönergeleri izleyerek. kas tonusu, istemli hareketlerin ve kuyruk tutam gibi caydırıcı uyaranlara yanıtları eksikliği kaybı izleyerek anesthetization onaylayın. </li><li> Bir diseksiyon tepsi üzerinde fare Pin ve ventral orta hat boyunca deri üzerinde bir kesi yapmak. fare göğüs kafesini maruz deride daha kesiler olun. diyaframı insizyon ve dikkatli bir şekilde kalpte ortaya çıkarmak için çevresi boyunca göğüs boşluğunu teşrih ve sağ atrium bir kesi yapmak. </li><li> Bir kelebek kanül kullanılarak, sol ventrikül kanüle. kan kaybı karaciğer renkte bir değişiklik ile teyit edilene kadar, fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.2 içinde 20 ml - transkardiyal 10 kullanılarak fare serpmek. Not: Karaciğer renk değişikliği kan kaybından kapsamını belirlemek için bir rehber olarak kullanılır. kırmızımsı kahverengi karaciğer renk değişiklikleri pembe soluk onaylayın. </li><li> % 2 Glutaraldehit 20 ml - transcardially 10 kullanarak fare serpmekaldehid ve% 4 paraformaldehid içinde hızlı bir şekilde beyin dokusu düzeltmek için, 0.10 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde yapılır. Sabitleme kuyruk sertleşme gözlemleyerek tarafından izlenir. pH ayarı, ve su ile 100 ml hacmi oluşturmak için hidroklorik asit ilave, 80 ml su içinde bir sodyum kakodilat içinde 2.14 g çözülerek 0.10 M kakodilat tamponu (pH 7.2) hazırlayın: edin. </li><li> Perfüzyon sonrasında, fare decapitate 4 O ° C&#39;de 48 saat süre ile 0.10 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) ihtiva eden% 2 glutaraldehid ve% 4 paraformaldehid içinde fiksasyonu takiben beyin, teşrih </li><li> 48 saat sonra, bir vibratome kullanarak 400 mikron koronal kesitler yapmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde diseksiyon mikroskobu 42 uyarınca (örneğin, hipokampus) beyindeki ilgili bölgeyi incelemek. Dikkatle doku Döşeme ve yönlendirmesini korunması için bir resim çekin. Not: SBFSEM doku boyama Mesaj işleme yöntemleri ağır metal boyama yöntemleri çeşitli birleştirirSipariş çözünürlüğü artırmak için ve Deerinck ve ark 40 tarafından daha önce geliştirilen yönteme dayanır. </li><li> glutaraldehid ile sabitlenmiş dokular 3 defa 5 dakika 0.1 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde, her bir yıkama. </li><li> 0.1 M sodyum kakodilat tampon maddesi (pH 7.2) içinde tannik asit çözülmesiyle% 0.1 tanik asit çözeltisi hazırlayın. çözülene kadar girdap ve gerekirse, 0.45 um&#39;lik bir filtreden filtre. </li><li> Oda sıcaklığında 60 dakika - Postfix&#39;i kakodilat olan dokular 30 1 mi reaktifi, inkübasyon yolu ile tanik asit,% 0.1 tamponlu. Not: kuluçka süresi doku büyüklüğüne bağlıdır, ancak 30 dakika çoğu dokuda en iyi şekilde çalışır. </li><li> dokular 3 defa 5 dakika kakodilat tamponu içinde her birinin (pH 7.2) yıkanır. </li><li> H2O damıtılmış 10 ml (dH 2 O) 0.3 g potasyum ferrosiyanat ve 0.86 g sodyum kakodilat eritin. Buz üzerinde potasyum ferrosiyanat çözüm tutun. Kullanımdan hemen önce,% 4 ozmiyum tetroksit (10 ml OsO 4) ekleyin. </li><li> % 2 os ile dokuları LekeBuz üzerinde 90 dakika süreyle MIUM-ferrosiyanür çözeltisi. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> 10 ml dH 2 O 0.1 gr TCH çözerek% 1 tiyokarbohidrazid (TCH) çözümü hazırlayın tamamen çözünene kadar her 10 dakikada bir dönen 60 ° C&#39;de çözülür. TCH tutarken kurumasına yüksek sıcaklık veya izin çözüm metallerin kullanımını, ısınmayı önlemek için özen özellikle güvenlik önlemlerine uyunuz. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca taze hazırlanmış% 1 TCH olan örnekleri tedavi edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> DH 2 O% 2 OsO 4% 4 seyreltilir, 1 saat süre ile inkübe edilerek% 2 sulu ozmiyum tetroksit ile leke dokular. DH 2 O. ile dokular 3 defa, 5 dakika her yıkayın </li><li> 4 ° C&#39;de dH 2 O içinde% 1 uranil asetat örnekleri O / N inkübe edin. </li><li> (Deerinck ve arkadaşları 40 tarafından tarif edildiği gibi) Walton kurşun aspartat çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 250 ml dH 2 O 0.998 g L-aspartat çözülürpH 5.5 ulaşıncaya kadar ve sonra da damla damla 10 N potasyum hidroksit (KOH) ekleyin. pH ayarlaması sonra 30 dakika boyunca 60 ° C, asit stok ve ısı aspartik 10 ml talebi nitrat, 0.066 g ekleyin. </li></ol></li><li> DH 2 O dokuları yıkayın ve 60 ° C fırın içinde 30 dakika boyunca Walton kurşun aspartat boyasıyla inkübe edin. DH 2 O 3 kez, 5 dakika her yıkayın </li><li> % 100 etanol ile, ardından, her biri 5 dakika için% 20,% 50,% 75,% 85 ve% 95 etanol soğutulmuş solüsyonlar kullanılarak alkolün kademeli dizi 3 kez 10 dakika her biri numune kurutmak. Not: açılan etanol havadan su emer gibi yeni açılmış şişeden% 100 etanol kullanın ve başarısız olmasına gömme neden olur. Uzun inkubasyon büyük doku örnekleri ile gerekli olacaktır. </li><li> Yıkama örnekleri 2 kez 15 dakika propilen oksidin her. </li><li> (Süksinik anhidrit dodesenil) 25 ml reçine, 10.5 ml DDSA kullanarak plastik gömme reçine, 15.5 ml NMA (nadik metil anhidrit) ve 1 ml yapınDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). sallayarak reçineyi karıştırın. Spin ve reçine kabarcıklar çözülene kadar bekletin. Not: Bu standart orta sertlikteki reçetedir. Elektron mikroskopisi (EM) plastik reçine diğer tipleri kullanılabilir ancak tüm reçineler SBFSEM için çalışmaz gibi önceden bir esansiyel olmayan kontrol numunesi ile test edilmesi gerekir. </li><li> - 10 saat, propilen oksit, yaklaşık 8 arasında bir süre boyunca buharlaşır, böylece 2 saat sonra, ilk başta daha sonra kapaksız kapaklı bir küçük şişe içinde, gömme reçine ve propilen oksidin 50 karışımı: 50 dokuların O / N inkübe edin. </li><li> 2 saat boyunca temiz şişelerde% 100 taze gömme reçine dokuları aktarın. </li><li> Düz kalıpların taze gömme reçinesi içinde yerleştirme örnekleri, kağıt etiketler basılmış ve 48 saat boyunca 60 ° C&#39;de bir fırında tedavi içeren. yaklaşık 1 saat sonra, tekrar doku yerleşimi ve hizalamayı kontrol ve gerekirse ayarlayın. </li><li> ilgi alanına örnekleri Trim ve gellin kullanarak bir alüminyum pim üzerine monteg siyanoakrilat superglue veya iletken epoksi reçine, daha sonra kolloidal gümüş ile kaplama alüminyum pin bir iletken yolu sağlamak için bloğun kenarlarına yapıştırın. </li><li> Bir in-bölme ultramicrotome evre ve düşük kV geri-saçılmalı elektron detektörü 32 ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu sistemi kullanılarak doku örneklerinin incelenmesi. Not: taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanın Araca ve site eğitim alın ve yetkili kullanıcı olmak. Alternatif olarak, küçük projeler için bir araştırmacı veya çekirdek tesisi ile işbirliği mümkün olabilir. SEM röntgen oluşturmak gibi Radyasyon eğitimi de gerekli olabilir. </li><li> örneklerin görüntü için aşağıdaki ayarları kullanın: 2.25 kV, 5 de - 10 nm / piksel çözünürlük, 80 arasında saha boyutları ile - x 250 mikron, y (diğer tarla mümkün boyutları) ve 50 dilim kalınlığı - 100 nm, 20 saat süre - 16 600 dilim - 250 toplamda. Not: Ayarlar farklı mikroskoplar arasında önemli ölçüde farklılık, indireysel örnekleri ve istenen çözünürlük. Bu ayarlar birçok örnekler için kolayca yorumlanabilir görüntüleri üretmek gerekir. </li></ol> 2. Görüntüleme DataSet Analizi Not: Resim J / Fiji yazılım veri kümesini analiz etmek için kullanılan ve TrakEM2 eklentisi dayanmaktadır edilir. Ön işleme aşamaları yazılımı kullanarak çeşitli yapılabilir ve geniş ya da deneyim düzeyine bağlı minör olabilir ve yığınlar aldı. açık kaynak kodlu yazılım kullanarak ana dönüşümler burada açıklanmıştır (1.50b ver ImageJ, FIJI 1 Ekim 2015 indir). <ol><li> yazılımda açılması ve menü Eşyaları Görüntü → Tipi → 8 bit seçerek orijinal patentli 16-bit görüntülerden 8 bit TIFF formatında görüntüleri dönüştürmek. <ol><li> Bu adım sırasında otomatik kontrast / parlaklık dönüşüm görüntüler için ideal değilse, 16-bit görüntüleri yeniden ve basın Görüntü Parlaklık / Kontrast → ayarla →. Tüm fotoğraflar için çalışan bir dizi seçin ve basın uygulayın. Sonra c gerçekleştirinonversion. Not: Bazı SEM&#39;ler, bu adım mikroskop üreticisi yazılımını gerektirebilir. </li><li> Nedeniyle dilimleri arasında kabul edilemez görüntü hareketi, Gerekirse (örn., Nedeniyle şarj drift), / kayıt görüntü yığınlarını (menü öğeleri Eklentiler Doğrusal StackAlignmentWithSIFT → → Kayıt) hizalayın. En kayıt yazılımı olarak, &quot;çeviri sadece&quot; modunda ziyade &quot;rijit gövde&quot; için ayarlayın. Birçok yaklaşımlar ve yazılım işe yarayabilir: Not birçok uygulama için SIFT kayıt plug-in eserleri ve sanal bir yığın sürümü var. <ol><li> Gerekirse, kayıt öncesi (Görüntü → canvassize → ayarlayın) ya da (Crop → Görüntü) ilgi alanına azaltmak tuval boyutunu büyütmek. Bazı sürüklenme veya meyletme oluşabilir ve diğer eklentileri veya yazılım çalışırken daha iyi sonuçlar doğurabilir: Not. Manuel seçenekleri de (örneğin. ImageJ / FIJI, Eklentiler → Kayıt → ManualLandmarkSelection) bulunmaktadır. </li></ol></li><li> desir Eğered, daha küçük, daha yönetilebilir boyuta ölçekli görüntüleri (örn.% 25) ImageJ (Görüntü → Ölçeği) kullanarak. </li></ol></li><li> yazılım, Dosya → ithalat → görüntü sırası başlatın ve ardından tiff dosyaları seçin. </li><li> (Boş) Yeni → TrakEM2 Dosya → seçerek eklenti başlatın. İki pencere açılacaktır; bir projeye ve area_lists yönetir ve diğer izleme yönetir ve tuval &quot;olarak adlandırılır. </li><li> tuval ithalatına sağ tıklama yaparak eklenti içine görüntü yığınını yükleyin. ithalat seçin ve ithalat yığının üzerine tıklayın. Pop-up seçeneklerinde sanal yığınlarının kutusunu işaretleyin. Not: Görüntü yığınları zaten yazılım açıldı rağmen, onlar da eklenti açılmalıdır. Sanal yığınları kutusu işaretlendiğinde ise bilgisayar daha sorunsuz çalışabilir. </li><li> Eşleşme oluşturulur ve yığın yüklendikten sonra, sağ eklenti pencerenin altında proje adı için tıklayın. Sağ şablon col &#39;yeni bir proje&#39; üzerine tıklayınUMN ve bu proje için &#39;yeni çocuk eklemek&#39; seçeneğini seçin. Sağ &#39;area_list&#39; seçmek için tekrar tıklayın. </li><li> Tuval üzerine sağ tıklayarak orijinal elektron mikroskobu ayarları ile kabul projenin Z ekseni ölçeği ayarlama, sonra ekranı tıklayın ve kalibrasyonu seçin. Ayrıca, eklenti penceresindeki tüm katmanları seçerek Z-ölçek ayarlamak, doğru ölçek Z ve kalınlığı seçmek için tıklatın. </li><li> Tıklayın ve &#39;proje&#39; ve proje tuval penceresinde &#39;Z boşluk&#39; sekmesi altında &#39;alan listeleri&#39; oluşturmak için bölüm nesneleri içine tüm &#39;çocuk&#39; sürükleyin. </li><li> &#39;Alan listesini seçin ve sağ seçin ve bir renk ayarlamak için tıklayın. Şimdi, elektron mikroskobu görüntüleri, mitokondri gibi nesneleri izlemek için boya fırçası aracını kullanın. Kullan &#39;Shift + tık&#39; kapalı bir daire içinde doldurmak için, &#39;Ctrl + kaydırma&#39; ve uzaklaştırmak için, ve bir silgi içine boya fırçası imlecini açmak için &#39;Alt + tık&#39;. </li><li> 15 mikron - ~ 10 iki alanları seçin10 tarafından - resmin sol üst köşesinde ve sağ alt köşesinde 15 mikron ve her veri kümesi içinde mitokondri tarafsız örnekleme izin vermek için bu alanlarda tüm mitokondri tespit. </li><li> &#39;Tuval&#39; Açık, gözlemlemek ve bölümler boyunca mitokondri iz. Not: Mitokondri benzer büyüklükteki oldukça karanlık / yoğun görünen organeller, çapı ve gevşek silindirik. iç zarı tarafından oluşturulan benzersiz kristalarında bu organel içinde kolaylıkla ayırt edilebilir. </li><li> izleme bittiğinde, sağ, Z uzay sekmesinin altında area_list tıklayın &#39;3D göster&#39; seçeneğini seçin. Bu takip görüntünün 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntülemek için 3D görüntüleyici eklenti başlatacak. <ol><li> mitokondriyal hacim ölçümleri, 3D görüntüleyici seçin nesne gerçekleştirmek için, &#39;Düzenle&#39; sekmesine tıklayın ve &#39;Object Properties&#39; seçiniz. mitokondriyal hacim tahmini birkaç diğer ölçümlerle birlikte listelenir. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Emily K Benson is a paid employee of Renovo Neural Inc., and Grahame J Kidd serves as Scientific Director for 3DEM at Renovo Neural Inc., which is a commercial provider of serial block-face SEM services and analysis.

Sinir sisteminin karmaşıklığı, yeterli çözünürlüğe sahip mitokondri gibi büyük doku hacimleri yeniden ve morfolojisi ve organellerin dağılımı analiz önemli bir sorun teşkil etmektedir. Nöronlar, oligodendrosit ve üç boyutlu olarak uzatılmış çok sayıda süreçlerle astrositlerin dahil olmak üzere birden hücreler, beyin dokusu 43 içinde etkileşimde. Mitokondri hücreleri ve uzak süreçlerin soma hem de bulunduğu için, mitokondriyal morfolojisi sinir sistemi (Şekil 1)</...

Mitokondri hücre iskeleti ile sıkı etkileşim içinde, onların şekil ve hücresel ipuçları ve ihtiyaçlarına bağlı olarak konumunu değiştirmek dinamik organelleri vardır ve bu tür nöronlar 1 kalsiyum kanal akımlarının gibi hücresel olaylara yanıt olarak. Diğer hücre organelleri sırayla kendi dinamiklerini ve metabolizmasını 2 düzenleyen endoplazmik retikulum, örneğin ile mitokondri de etkileşim. Mitokondriyal morfolojisi yani farklı hücre tiplerinde heterojenitesini gösterir. organelle şekli bu levhalar, çuvallar ve oval 3 oluşan için boru şeklinde değişir. Mitokondriyal füzyon ve fisyon döngüsü proteinleri yer, boyut, şekil ve mitokondri 4 dağılımını düzenler gösterilmiştir. Ayrıca, mitokondriyal şekil değişimleri nörodejenerasyon, nöronal plastisite, kas atrofisi, kalsiyum sinyali, reaktif oksijen türleri üretimi gibi ömrü ve hücre ölümü karıştığı THA ile ilişkilidirT hücre spesifik mitokondriyal morfolojisi normal hücresel fonksiyonun 5-11 bakımı için kritiktir. Mitokondri önemli bioenergetic fonksiyonu TCA döngüsü yoluyla tam besin dağılımı (yani, glükoz, yağlı asitler ya da amino asitler) içerir ve OXPHOS 12 geçiş yolu, metabolik reaksiyonlar bir dizi yürüterek adenosin trifosfat (ATP) üretmektir. İnsan beyni vücut ağırlığının sadece% 2 ancak ~ o organı 13 zorlu bir derece enerji verme üretilen toplam enerjinin% 20&#39;sini tüketir oluşturmaktadır. İnsanlarda mitokondriyal fonksiyon bozukluğu, nörolojik belirtiler 14-17 çok sayıda yol açtığı şaşırtıcı değildir. Genetik ~ 1 bir prevalans ile bozuklukların klinik heterojen bir grup olan mitokondriyal hastalıkların 17,18, ATP nesil açar bozan OXPHOS bileşenleri mutasyonlar: 5.000 birey ve m en yaygın nedenlerinden biridirçocuklarda ve erişkinlerde etabolic bozukluklar. Mitokondri türevi ATP açığı, beyin, kalp ve iskelet kasları ağırlıklı bu hastalarda 14,17,18 de etkilenen gibi yüksek enerji gerektiren organları ile çoklu organ sistemleri etkiler. Son yıllarda, birçok çalışma nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların 15-17,19,20 hem mitokondriyal disfonksiyon için kanıtlar sağlamıştır. mitokondri temel ve beyin gelişimi ve işlevi için kritik olduğundan, hem sağlıklı ve hastalıklı devletlerin altında beyin mitokondriyal morfoloji, yapısı, büyüklüğü, sayısı ve dağılımında değişikliklere analiz protokolleri geliştirmek zorunludur. Mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteini (GFP) sıçan modelleri beyin 21,22 mitokondriyal hareketleri ve lokalizasyon görselleştirmek için üretilmiştir. Bu mitokondriyal hareketliliği ve genel dağılımını incelemek son derece yararlı bir araç olsa da, includ bazı dezavantajları vardırE sınırlı çözünürlük ve floresan mikroskobu duyarlılığı. Bu nitelikler zor nispeten küçük ölçekli mitokondri izlemek için yapmak. Benzer şekilde, seri transmisyon elektron mikroskobu başarıyla sinaptik mitokondri 23 görüntülemek için kullanılan, ancak bu yöntem çok zaman alıcı değil. Mitokondriyal morfoloji, sürekli fizyon ve füzyon döngülerine tabi olarak son derece dinamik olduğu bilinmektedir ve çoğu hücrelerde mitokondri son derece bağlı bir ağ 24-26 korumak olduğunu. Nöronlar çok onlar bu neurites yollarını (Şekil 1) yapmak gibi ayrı gerekebilir birden dendritler ve genişletilmiş akson ve hücre gövdesinde bağlı bir retiküler ağ oluşturmak mitokondri hücreleri polarize edilir. Bu boyut ve şekil son derece çeşitli beyin mitokondri yapar. Örneğin, bir seri bloğu yüz tarama elektron mikroskobu kullanılarak (SBFSEM) tekniği, daha önce gözlenen extrasynaptic mitochondr hacmi ya da boyut olarak farklılıkon altı 27 kat olarak sinir uçlarında bulunan mitokondri ia kadar olabilir. Sesi gerçekleştirmek için çeşitli yaklaşımlar vardır ultramicrotome SEM 30 toplama seri bölüm TEM 29, otomatik bant içeren, 28 analizleri, iyon ışın SEM 31 ve SBFSEM 32 duruldu. SBFSEM analizi, beyin 1 mm&#39;ye kadar alanda mitokondri gibi morfolojik şekil, boyut, dağıtım ve organellerin sayısal verisi sağlamak için çözünürlüğü sahip olduğu avantajlara sahiptir. Teknik çalışma bir önceki EM deneyim eksikliği birçok biyolojik laboratuvarlar yetenekleri dahilinde veri toplama ve analizi ile, aynı zamanda en az talep ediyor. Seri bölüm benzeri görüntüler üretmek için ticari araçların gelişi dokuların 3D ultrastrüktürel analiz yapmıştır ayrıca hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde 28 tarafsız bir hacimsel analizini veren bir rutin teknik, </&gt; Sup. SBFSEM sonra ilk nöronal devrenin 34 rekonstrüksiyonu analizinde önemli bir araç olarak bu tekniği kurduk 1981 yılından bu yana 33. Birden çalışmalarda Leighton tarafından tanıtılan bir fikrine dayanan, 2004 32 nörobiyoloji alanında tanımlanan ve kullanılmıştır. Ayrıca, birçok küçük ölçekli projeler için, hücresel organellere 27,35-39 belirlemek için yeniden analiz sağlar. Bu yana, edinilen görüntüler alçak gerilim geri saçılım elektron türetilmiştir, bilinen farklı ağır metal boyama tekniklerini birleştiren yeni boyama protokolleri çözünürlüğü 40 artırmak için geliştirilmiştir. Bu yazıda, 3D elektron mikroskopi görüntüleme ve daha önce bize ve diğerleri 38,39,41 tarafından kullanılmış olan yöntemlere dayalı beyin mitokondri hacimsel analizini kullanan bir protokol sağlar. Doku sonrası işleme yöntemleri, daha önce Deerinck ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir kullanılan40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, tradename Fluriso</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>S65105&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly canula</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.45 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NC0813356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome sectioning system</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>Vibratome 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% Solution</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>43731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td>Contains Embed 812&#160; resin, DDSA, NMA, and DMP-30.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>20400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum specimen pin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Silver Liquid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234790</td>
			<td>Hardware/craft stores carry this item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>16043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Sigma VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In chamber ultramicrotome for SEM</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3View2</td>
			<td>Can be designed for other SEMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming microscope for pin preparation</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td colspan="2">supplied as part of 3View system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low kV backscattered electron detector</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3V-BSED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/ Fiji processing package&#160;</td>
			<td colspan="2">ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td>
			<td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy

İnsan beyni ağırlıklı bir yakıt kaynağı olarak glikoz dayanan bir yüksek enerji tüketen organdır. Glukoz adenosin trifosfat (ATP) şeklinde hücresel enerji üretmek için glikoliz, tri-karboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yollar ile beyin mitokondrilerde katabolize edilir. mitokondriyal ATP üretimi düşüklüğü belirgin nörolojik ve myopatik semptomlar ile klinik mevcut mitokondriyal bozukluklar neden olur. Mitokondrial kusurlar da nöro bozuklukları (örneğin otizm spektrum bozukluğu) ve nörodejeneratif bozukluklarda mevcut (örneğin, amiyotrofik lateral skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları). Böylece, sağlıklı ve hastalık durumları hem altında mitokondriyal morfolojisi, yapısı ve dağıtım 3D analizini gerçekleştirmek için alanında artan bir ilgi var. Beyin mitokondriyal morfoloji özellikle bazı mitokondri ile bu son derece çeşitlidirsinaptik bölge geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü sınırının altındadır &lt;200 nm çaplı aralığında olmak. beyinde mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteinini (GFP) ifade anlamlı konfokal mikroskopi ile organel algılama arttırır. Ancak, büyük ölçekli mitokondri görüntüleri oversaturating olmadan nispeten küçük ölçekli mitokondri saptanmasının duyarlılığı üzerindeki kısıtlamaları aşmak değil. seri geçirimli elektron mikroskobu başarıyla nöronal sinaps mitokondri karakterize etmek için kullanılmış olsa da, bu teknik son derece zaman alıcı birden fazla numune karşılaştırırken özellikle olduğunu. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) tekniği, doku ve veri toplama görüntüleme blokları kesit bir otomatik süreç gerektirir. Burada, hızla yeniden ve mitokondriyal morfolojisi görselleştirmek için kemirgen beyin tanımlanmış bir bölgenin SBFSEM gerçekleştirmek için bir protokol sağlar. bu teknolojinique da tanımlanan bir beyin bölgesi mitokondriyal sayısı, hacmi, boyutu ve dağılımı üzerindeki doğru bilgi temin etmek için kullanılabilir. Elde edilen görüntü çözünürlüğü (genellikle 10 nm altında) yüksek olduğundan herhangi bir brüt mitokondriyal morfolojik bozukluklar da tespit edilebilir.

Beyin mitokondriyal morfolojisi ve boyutu farklı nöronal alt bölümlerinde heterojen olduğunu göstermektedir. Lentivirüs mitokondriyal hedefli yeşil flüoresan protein ifade ile dönüştürülmüş düşük yoğunluklu nöronal kültürlerinde mikroskopisi uzak neurites kalanların ayrı uzatılmış morfoloji (Şekil 1 AB) sergilemek ise nöronal soma ikamet eden mitokondri, bir retiküler ağ oluştururlar olduğunu gösterdi. SBFSEM teknik kullanılarak, mitok...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Görüntüleme.  Virginia Tech Carilion Research Institute. Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle. 

Video: Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Nörobilim

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Kronik yaygın Marmoset bütün kortikal Electrocorticographic dizide implantasyonu

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase uptake of antibodies and engagement through transient opening of the blood-brain barrier (BBB). In our laboratory, we are developing therapeutic approaches for neurodegenerative diseases in which an antibody in various formats is delivered across the BBB using microbubbles, concomitant with focused ultrasound application through the skull targeting multiple spots, an approach we refer to as scanning ultrasound (SUS). The mechanical effects of microbubbles and ultrasound on blood vessels increases paracellular transport across the BBB by transiently separating tight junctions and enhances vesicle- mediated transcytosis, allowing antibodies and therapeutic agents to effectively cross. Moreover, ultrasound also facilitates the uptake of antibodies from the interstitial brain into brain cells such as neurons where the antibody distributes throughout the cell body and even into neuritic processes. In our studies, fluorescently labeled antibodies are prepared, mixed with in-house prepared lipid-based microbubbles and injected into mice immediately before SUS is applied to the brain. The increased antibody concentration in the brain is then quantified. To account for alterations in normal brain homeostasis, microglial phagocytosis can be used as a cellular marker. The generated data suggest that ultrasound delivery of antibodies is an attractive approach to treat neurodegenerative diseases.

Presented here is a protocol to transiently open the blood-brain barrier (BBB) either focally or throughout a mouse brain to deliver fluorescently-labeled antibodies and activate microglia. Also presented is a method to detect the delivery of antibodies and microglia activation by histology.

Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler