Bu yaklaşım, sağlıklı ve hastalıklı beyinlerin geliştirilmesinde uzun süre boyunca nakledilen internöronların hücresel kimliğini, entegrasyonunu ve işlevselliğini araştırmaya izin verir. Protokol, naif ve transgenik farelerin hipokampüsünde hayatta kalan ve olgunlaşan öncüller gibi insan kök hücre kaynaklı GABAerjik internöronun hızlı ve yüksek verimli bir neslini tanımlar. Bu yaklaşım, internöronların tehlikeye girdiği gelişimsel bozukluklarda hücre tedavisini kullanmanın terapötik potansiyelini değerlendirmemize yardımcı olur.
Başlamak için, hücre kültürü ortamını insan kaynaklı internöron öncüllerinden çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum olmadan DPBS ile dikkatlice durulayın. Altı delikli plakanın her bir kuyucuğuna 400 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Hücrelerin sınırı parlak görünmeye başlayana kadar inkübatörde 37 santigrat derecede iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, hücre ayırma çözeltisini durdurmak için altı delikli plakanın her bir kuyucuğuna 600 mikrolitre taze N2 ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri bir pipet kullanarak mekanik olarak ayırın. Hücre süspansiyonunu plastik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca 180 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı bir vakum sistemi kullanarak atın ve peleti transplantasyon ortamında yeniden askıya alın.
Bir sayım odası ve bir uyarı sinyali sayacı kullanarak süspansiyondaki toplam hücreleri sayın ve ses seviyesini mikrolitre başına 100.000 hücrelik son bir konsantrasyona ayarlayın. Hücre süspansiyonunu en fazla dört saat boyunca transplantasyona kadar buz üzerinde kapalı bir tüp içinde tutun. Anesteziden hemen sonra, yavruyu üst uzuvlar beyazımsı hale gelene kadar üç dakika boyunca ıslak buz yüzeyindeki ıslak bir doku üzerine yerleştirin.
Hücreleri pipetle dikkatlice yeniden askıya alın ve şırıngayı hücre süspansiyonu ile yükleyin. Yavruyu stereotaksik çerçeveye yerleştirerek ve kulak çubuklarını ters yönde kullanarak konumlandırın. Daha sonra, etanol içine batırılmış yumuşak bir doku kullanarak cildin yüzeyini temizleyin.
Lambda'yı tanımlayın ve stereotaksik enstrümanın dijital ekran konsolunda koordinatları sıfıra ayarlayın. Hamilton şırıngasını istenen koordinatlara yerleştirdikten sonra, kafatasına nüfuz etmek için 90 derecelik bükülmüş bir insülin iğnesi kullanın ve küçük bir delik açın. Ardından, iğne kafatasını geçene ve dorsoventral koordinatı sıfırlayana kadar Hamilton şırıngasını aşağı indirin.
İstenilen dorsoventral koordinatlar elde edilene kadar iğneyi indirin. Kök hücreler enjekte edildikten sonra iğneyi yavaşça geri çekin. Anneye geri vermeden önce hareket etmeye başlayana kadar yavruyu elleriyle ısıtarak prosedürü sonlandırın.
Transplantasyon yapılan hücrelere karşı herhangi bir immün reaksiyon veya lokal inflamasyon, Iba1, CD68 ve galektin-3 kullanılarak tanımlanan reaktif mikroglianın yokluğu ile değerlendirildiği gibi, nakil sonrası 14. günde veya iki ay sonra bulundu. Astrogliozun derecesi, glial fibriler asidik protein ve interlökin-1 gibi enflamatuar sitokinler ve sitotoksik lenfositlerin yokluğu ile belirlenir. Cntnap2 nakavt farelerinde, insan kök hücresinden türetilmiş internöron benzeri hücreler, transplantasyondan dokuz ay sonrasına kadar hayatta kaldı ve enjeksiyon bölgesinde lokalize edildi.
Bununla birlikte, vahşi tip farelerde gözlendiği gibi, ipsilateral ve hatta kontralateral hipokampus boyunca da dağılmışlardır. Protokol, beynin minimum bozulmasını ve sıkıştırılmasını sağlamak ve prosedürün hızı ile koordinatların hassasiyeti arasında iyi bir denge kurmak için pratik gerektirir. Bu protokol, araştırmanıza, ilgilendiğiniz soruya bağlı olarak, bağlantı çalışmaları veya elektrofizyoloji veya davranışsal çalışmalar gibi fonksiyonel okumalar gibi bir dizi teknikle uyumludur.
