1. Hazırlık <ol><li> Xylazine ketamin çözüm (Ketamin kontrollü bir maddedir. Ayrıntılı kayıtları tutulur ve çözümleri, güvenli, kilitli bir yerde muhafaza edilmelidir) hazırlayın. </li><li> Ekipmanı temizleyin ve sterilize edin. </li><li> Aseptik maddesi ile silme ve ardından steril kağıt havlu ile kapsayan cerrahi alanında hazırlayın ve mikromanipülatör kurmak. </li></ol> 2. Hücre nakli için hazırlık <ol><li> Fare başına düşen sadece 250,000 hücreleri nakledilen olmasına rağmen hücreler, 100.000 hücre / É l bir konsantrasyon yeniden bekletildi ve olmalıdır, hücrelerin aşırı şırınga yükleme amacıyla hücrelerini aldıktan fare başına en az 300.000 hücre hazırlamak için gereklidir. </li><li> 50 ml konik flakon HBSS içinde 3 kez nakledilen hücrelerin yıkayın. Final spin önce hücreleri saymak. </li><li> Sonra aşağı final spin, süzün HBSS ve damlacıkları pelet ulaşmasını önlemek için konum aşağı ters flakon terk. </li><li> UV-ışınlanmış, steril Kimwipe Kuru iç duvarları. Pelet kurumasına izin vermeyin. </li><li> Yavaş yavaş, tüp dik Holding ve çok ince HBSS yarısı son istenen birimde hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir pipet süspansiyon çoğunluğu pipetleme ve ardından tüm süspansiyon pipet ucu kadar pipetter çevir ayarlayarak toplam hacmi ölçün. Bu ne kadar daha HBSS istenen konsantrasyon için gerekli size söyleyecektir. </li><li> HBSS ekleyerek istenilen miktarda hacim kazandırın. </li><li> Buz üzerinde geri yerleştirin. 2 saat daha uzun buz gerekiyorsa hücre canlılığı kontrol edin. </li></ol> 3. Cerrahi ve transplantasyon için farelerin hazırlanması <ol><li> Intraperitoneal ketamin (100mg/kg) ve ksilizin ~ 100 ul dozda (10mg/kg) veya eşdeğer bir anestezik enjeksiyon ile fare anestezisi. Cerrahi hazırlık dikilmesi için tüm işlem 30-40 dakika sürer. </li><li> (Opsiyonel: tanımlanmasını sağlamak için her fare kuyruk numaralı, renkli bant uygulamak) </li><li> Boyun alt sırt fare dorsal bölgede Tıraş ve elektrik kesme makineleri ile ikili orta hatta 2 cm uzanan. Saç (bölge üzerinde birkaç kez gitmek için gerekli olabilir) mümkün olduğunca yakın kesilmelidir. </li><li> Kalan saç kaldırmak için bir gazlı bez ile tüy dökücü krem ​​(Nair) ince bir tabaka uygulayın uçlu bir aplikatör. </li><li> 1-2 dakika sonra, kapalı Nair, sabunlu su ile hafifçe ıslatılmış gazlı bez ile silin. Hazırlanan alan sonraki cerrahi işlem sırasında yara alabilir, herhangi bir saç sokak parçaları olmadan çıplak deri temiz olmalıdır. Hazırlanan alan iyodür solüsyonu ile sterilize edin. </li></ol> 4. Laminektomi <ol><li> Prosedürü boyunca eldiven Sıkça değiştirebilir ve / veya sterilize edin. Kafası (sağ elle) sol işaret fare dorsal tarafına yerleştirin. Kısırlık sağlamak ve sadece traş alana maruz kaldığı hayvan Örtüsü. Laminecomy sitesi T12 hakkında torasik vertebra T8 kapsayan üzerinde dikey bir kesi (1.3cm) olun. </li><li> Sol elinde düzenlenen Graefe forseps ile sıkıca omuriliğe T9 (Şekil 1A), güvenli ve omurga eğriliğinin abartmak için fareyi yukarı kaldırın. </li><li> T10 ve T11 arasında kavşak, iki dikenli çıkıntılar arasındaki boşluğu puan neşter kullanın. Ayrıca kemik açığa çıkarmak için (Şekil 1B, C) ​​dikkatle uzakta kas tabakası hurdaya kavşak maruz kalmaktadır. </li><li> Lamina ve pedikül küçük snips etrafında açık kas daha makas kullanın. Bu omurlar arasındaki küçük bir alan açılacaktır. Yavaş yavaş ve ince makas bu boşluğu içine bir bıçak takın ve pedikül snip. Makas eğriliği her zaman kabloyu uzak, yatay konumlandırılmış emin olun. Diğer tarafta tekrarlayın. (Bkz. Şekil 1D, E) </li><li> Kabloyu maruz lamina kaldırın ve dikkatli bir şekilde kapalı snip. Arkasında herhangi bir ücretsiz veya sivri kemik parçaları bırakmamaya emin olun. (Bkz. Şekil 1F) </li><li> Enjeksiyon için, önce herhangi bir kan steril pamuklu çubukla temizleyin. </li></ol> 5. Hücre enjeksiyonu <ol><li> Hamilton şırınga iğne iğne somunu takın ve onlara temiz su, sonra% 70 etanol ile birkaç kez ateş basması, ve nihayet HBSS. Su,% 70 etanol veya HBSS her doldurduktan sonra piston yerleştirin. </li><li> Hamilton şırınga pistonu çıkarmadan ve iğne somunu gevşeterek ve iğne, backpressure önlemek için şırınga uzak çekerek hücre yükleme için hazırlayın. Iğne ve somun dikkatli kullanımı, steril eldiven ile yapılır emin olun. </li><li> Pipet içine hücre 15μl Yük ve ucu şırınganın içine hücreleri yüklemek için şırınga arka ucunu sıkıca basın. </li><li> 5mm hakkında pistonu takın ve ardından iğne somununu sıkın. </li><li> Piston un sıkıptil bazı hücre süspansiyonu iğne çıkmadan görülür. </li><li> Şırınga içinde kabarcıklar vardır ve yerçekimi ile bir degrade hücreleri önlemek için yatay pozisyonda şırınga uzandı emin olun. </li><li> T8 ve T9 (Şekil 2B, C) ​​dikenler bağlayan spinalis dorsi laminectomized fare basılı tut. </li><li> Kelepçe, farenin ön pençeleri havada ve arka pençeleri Şekil 2A ve 2B olarak hafifçe böylece steril kağıt havlu bir platform dokunarak sol (düşey) mikromanipülatör kol hemostat . </li><li> Takın, sağ mikromanipülatör kol (70 ° açıyla) şırınga ve şırınga sıkma önce mümkün olan en düşük pozisyona kaydırın. </li><li> Kağıt havlu karşı kuyruk iğneleyerek ve yavaş yavaş şırınga (Şekil 2B) alt fare sabitleyin. </li><li> Kabloyu doğru iğne Alt ve dorsal orta hat (Şekil 2C) ile ters yarımkürede içine iğne 1mm eklemek . Iğne ucu merkezi kanalına yakın gri cevherde olmalıdır. </li><li> 2.5μl hücrelerin yavaş yavaş enjekte. 1μl / 5 saniye hızında enjekte edilir. Hücreler enjekte ettikten sonra, iğne kablosunun her 10 saniye kadar bir seferde 10 saniye bekleyin ve iğne bir dönüş onda geri çekin. Hücre süspansiyonu mümkün efflux dikkat edin. </li><li> Şırıngaya hızla geri çekin ve mikromanipülatör kolundan ayırmak. Şırınga yatay aşağı yatırın. </li><li> Fare ve dikiş tabloya transfer bırakın. </li><li> Şırınga boşaltılır kadar her fare için 5,7-5,14 adımları tekrarlayın. Araçları (sterilizatör) ve hayvanlar arasındaki iğne (etanol ile silerek) sterilize edin. Hücreler atılır ve topaklanma görülebilir yeniden. </li><li> Yükler arasında adım 5.1 olarak şırınga temizleyin. </li></ol> 6. Dikişler ve post-op bakım <ol><li> Kesi dikin. Sütür iğne kesi her iki tarafta yüzeysel fasya içine eklenir. Konu böylece kaldırılır lamina yerinde maruz omurilik kapsayan, (Şekil 3A) birlikte yüzeysel fasya çekerek üzerinden sinirli. , Deri ya da arka iskelet kası bağlı deri kas sütür etmeyin. Iğne tutucu, üç knot oluşan ve iplik düğüm mümkün olduğunca yakın olarak kesilmiş yaklaşık 1 / 2 &quot;. Bırakarak aracılığıyla tüm konu çekin. </li><li> 02:58 zımba (kesi büyüklüğüne bağlı olarak) deri (Şekil 3B) uygulayarak kesi kapatın. Dikkatlice altta yatan kas zımbalama önlemek için fare uzak cilt çekin. </li><li> 26G3 / 8 iğne kullanarak alt kutanöz kesi uzak alt sırt, 0.5 ml Laktatlı Ringers enjekte edilir. </li><li> Kendi kafesine geri koyun fare. Anestezi altında cerrahi sitesi ve kafesli yataklar arasındaki temas kaçınarak, fare, kafese yana yatık olmalıdır süre rahat nefes sağlamak. Kafesler ısıtma pedleri konulmalıdır. </li><li> Anestezi, kanama azalır sağlamak için kapalı giyer sonra Fare izlenir, dikiş kapalı kalır ve bu farelerin ameliyat öncesi hareketlilik dönmek. </li><li> Analjezik buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) aşağıdaki cerrahi ile farelerin bir kez davranın. </li><li> Bozulmuş farelerin yiyecek ve su yeterli erişimi olduğundan emin olun: 3.5 inç emzikli ve elle beslenen su ve / veya yüksek kalorili besin takviyesi (Nutri-Cal, Tomlyn) yürüyemez fareler uzun su şişeleri ile donatılmıştır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Istenen sonuçları enjeksiyon sırasında hücre süspansiyonu efflux eksikliği ve prosedürü takip omurilik sağlam görünüşü tanımlanabilir olacaktır. Bu amaçla, laminektomi sırasında ve enjeksiyon sırasında farenin omurga üzerinde parlak ve direkt aydınlatma için hayati önem taşımaktadır. Optimal aydınlatma, fiber optik aydınlatma (Şekil 2A) tarafından kolaylaştırılır . <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 - Laminektomi (A) Bir omur T9 sağlam puan mikro makas girişini kolaylaştırmak için T10 ve T11 arasında bistüri ile omurga (B, C), Graefe forseps ile tutulur. (D), T10 ve T11 (oklar ve içerlek, E) arasında dikkatlice uzayda mikro makas slayt ve dorsal lamina serbest bırakmak için her iki tarafta pediküller (tire, E) kesmek. (F) rostrally lamina yukarı kaldırın ve kesti. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. NSC&#39;lerde enjeksiyon (A), 70 açıyla sağ kol, sol kol ve Hamilton şırınga bağlı fare tutarak hemostat mikromanipülatör genel kurulum. (B) hemostat, T8 ve T9 dikenler bağlayan spinalis dorsi tutun. (C) iğne, t ile indirilir.o orta hat ve merkez kanalın proksimalinde ters yarımkürede gri madde, içine. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Dikişler ve yaranın kapanması (A) Dikişler kesi her iki tarafta yüzeysel fasya uygulanır. (B) gerektiği gibi 2-3 zımba ile (3 gereken bir yara üzerinde gösterilen bir elyaf) kesi kapatılır.

<ol>
	<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system:+host-virus+stand-off.">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li><li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+multiple+sclerosis:+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease.">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li><li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+(MHV-4):+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease.">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li><li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li><li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response.">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li><li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , (1992).</li><li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li><li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li><li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury.">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li></ol>

Iyi uygulanmış bir nakli hücreleri dikkatli laminektomi ve enjeksiyon öncelikle menteşe. Bir laminektomi sırasında önlemek için birincil hatadır omurilik zarar. Bu işlem sırasında veya prosedürü takip geride bırakmış keskin kemik parçaları nedeniyle hasar oluşabilir. Bunları önlemek için, kavisli mikro makas noktaları, her zaman kabloyu uzak bakacak şekilde sağlamak ve tüm kemik parçaları temizlenmiş olduğundan emin olmak için dikkatlice laminectomized omurga incelemek ve kalan vertebral yapısı açıkça çıkıntılı ya da pürüzlü sahip değildir kenarları bu. Daha önce de belirtildiği gibi ışık enjeksiyon sırasında, parlak ve doğrudan maruz omurilik üzerine parlayan ise, efflux tespiti mümkün olacaktır. Efflux 30 insülin iğnesi (karşı 33 gauge) ve enjeksiyon çok hızlı bir şekilde yapılır gerçekleşmesi en muhtemel. Bu protokol bize iyi sonuçlar vermiş olsa da, diğerleri geri çekilmeden iğne aşağıdaki enjeksiyon 8,9 önce (5 dakika) bekleme süresi uzun bildirdin. Ayrıca, daha küçük ölçü iğneler tercih edilir, ancak 33 insülin iğnesi geçerken bazı hücreler çok kolay parçalanmış olduğunu gözlemledim. Verimliliği maksimize etmek için, dört farklı istasyonları (fare hazırlık, laminektomi, enjeksiyon ve dikişlerle) personel nakli ekibi arzu edilir. Ayrıca, her bir işlem için zamanlama hücreleri buz üzerinde bekliyor süresini en aza indirmek için optimize edilmelidir. Örneğin, dört (şırınga her yük doz sayısı) gruplar halinde farelere nakli, kişi hücreler enjekte edildikten sonra üçüncü fare laminectomized şırınga yükleme başlar ve farelerin hazırlayan kişi aşağıdaki uyutmak önceki grubun ikinci fare sonra grup laminectomized olmuştur. Bu şekilde, her bir fare yaklaşık 30-40 dakika alacak olsa bile biz yaklaşık 3 saat 40 farelere hücreleri (veya kontrol medya) nakli. Hücre replasman tedavileri bazı merkezi sinir sistemi bozukluklarının tedavisi için 10 klinik çalışmalarda şu anda. MGK transplantasyonu ve viral kaynaklı demiyelinizasyon MS önemli bir model kullanımını kolaylaştırır farelerin omurilik içine NSC&#39;lerde engraftman için protokol vivo modeller için herhangi bir yerini tutamaz ve aynı zamanda diğer modellere kolayca adapte edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix İlaç </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine hidroklorür </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Kilise ve Dwight A.Ş. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  ul Hamilton Şırınga w / Çıkarılabilir iğne </td><td> Hamilton Şirket </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton İğneler, 30G veya 33 G, ½ inç, 30 ° eğim </td><td> Hamilton Şirket </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Test kullanmak için en iyi göstergesi belirlemek için iğne geçişi aşağıdaki hücrelerinin canlılığı </td></tr><tr><td> Mikro Makas </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Küçük Graefe Forseps </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 1772 Evrensel Tutucu </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 1773 Elektrod Tutucu </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 902 küçük hayvan stereotaksik </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaksik </td><td> Kopf Aletleri </td><td> Model 960 sol elektrot taşıyıcı </td><td></td></tr><tr><td> Dikişler </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Laktatlı Ringers </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Güzel Bilim </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturiler, boyutları 10,11 </td><td> Balıkçı </td><td> 268.878, 268.879 </td><td></td></tr><tr><td> Dikişler </td><td> Ethicon </td><td> 1676G </td><td> boyutu 5-0, 3 / 8 &quot;daire, 19mm iğne, 45cm örgülü iplik </td></tr><tr><td> Refleks 7 yara klip aplikatör </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm Refleks yara klipleri </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar iğne tutucu </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

Nörotropik JHM suşu (MHV) fare hepatit virüsü ile enfekte Fare demiyelinizan hastalık Multipl Skleroz (MS) olan hastalarda benzer patolojik ve klinik sonuçları geliştirmek. Biz hem remiyelinizasyon ve klinik sonuç önemli bir gelişme hasta farelerin sonuçları omurilik içine NSC&#39;lerde bu nakli göstermiştir. Hücre replasman tedavileri kronik nörolojik hastalıkların tedavisi için artık bir gerçeklik ve in vivo modellerde engrafted hücreleri ve ev sahibi doku mikro-çevre arasındaki etkileşimleri anlamak hayati önem taşımaktadır . Bu sunum adapte JHMV enfekte farelerde omuriliğe hücre nakli için bir yöntem sağlar. Kısacası, biz)) ii, nakli önce) post-operatif bakım farelerde pre-operatif bakım, iii) laminektomi ile omurilik maruz kalma, iv) NSC&#39;lerde stereotaktik enjeksiyon, ve iv NSC&#39;lerde hazırlanması i için bir prosedür .

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus at JoVE.com

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Kurulan demiyelinizasyon ile farelerin omurilik içine fare sinir kök hücrelerinin (NSC&#39;lerde) nakli ayrıntılı. NSC&#39;lerde hazırlanması, torasik vertebra 9 (T9) ve NSC&#39;lerde nakli laminektomi farelerde pre-ve post-operatif bakım birlikte özetlenmiştir.

Spinal Kordonlar nörotropik Mouse Hepatit Virüs ile Etkilenmiş Fare Fare Nöral Kök Hücre Transplantasyon Cerrahi

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Kurulan demiyelinizasyon ile farelerin omurilik içine fare sinir kök hücrelerinin (NSC'lerde) nakli ayrıntılı. NSC'lerde hazırlanması, torasik vertebra 9 (T9) ve NSC'lerde nakli laminektomi farelerde pre-ve post-operatif bakım birlikte özetlenmiştir.

Video: Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...