Bu protokol, insan periventriküler endotel hücrelerinin işlevlerini ve insan GABAerjik internöronlarla etkileşimini topluca değerlendiren üç in vitro tahlilleri açıklamaktadır. Bu tahlillerden elde edilen sonuçlar periventriküler endotel hücreleri ve beyin bozuklukları arasındaki bağlantıya eleştirel bir bakış açısı sağlayacaktır. Bu tahliller basit, düşük maliyetlidir ve diğer mevcut tahliller tarafından elde edilemeyen santimetre aralığında hücre geçişinin ölçülmesine olanak sağlar.
Gabaerjik internöronların göç ve dağılımındaki bozukluklar otizm, epilepsi, şizofreni ve depresyon gibi psikiyatrik bozukluklarla ilişkilidir. Bu nedenle, bu hastalıkların patogenezi ele insan bağlamında GABAerjik internöronlar ile periventriküler endotel hücrelerinetkileşiminin incelenmesi önemlidir. İnsan hücrelerini araştırma için hazırlayarak başlayın.
İnsan periventriküler endotel hücrelerinin %70 ila %80 biraraya gelmesine izin verin, sonra bunları makalenin talimatlarına göre ayırın ve trippan mavi dışlama yöntemini kullanarak sayın. İnsan GABAerjik internöronlar hazırlamak için, sıcak hücre dissosyasyon çözümü ve nöronal orta bir aliquot için 37 derece santigrat için 10 dakika. Daha sonra her kuyuiçeren hücrelerden orta aspire ve iyi başına PBS bir milimetre ile yıkayın.
Hücreleri kuyu başına 0,5 mililitre önceden ısıtılmış dissosiasyon çözeltisi ekleyerek ve 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırarak ayırın. Kuluçkadan sonra, kuyu başına bir mililitre nöronal ortam ekleyin ve hücre çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, hücre kümelerini ayrıştırmak için hafifçe triturating. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 380 kez G'de santrifüj edin, süpernatantı aspire edin ve hücre peletini bir mililitre nöronal ortamda yeniden askıya alın.
Sonra trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri saymak. Hücre dissosyasyon çözeltisi ve 37 santigrat derece endotel orta bir aliquot, kullanımdan 10 dakika önce ısıtarak kontrol insan endotel hücreleri hazırlayın. Her kuyudan aspire ortamı ve her kuyuda bir mililitre PBS ile yıkayın.
Her kuyuya önceden ısıtılmış ayrıştırma çözeltisinin 0,5 mililitresini ekleyerek ve tabağı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri ayırın. Daha sonra, dissosyasyon çözeltisi nötralize etmek için iyi başına endotel hücreli orta bir mililitre ekleyin ve 15 mililitre konik tüp hücreleri aktarın. Hücreleri 200 kez G'de beş dakika santrifüj edin, süpernatantı aspire edin ve bir mililitre endotel hücreli ortamda hücreleri yeniden askıya alın.
Sonra hücreleri saymak için trypan dışlama yöntemini kullanın. Steril bir bıçakla iki iyi silikon kültür eklemek bir kuyunun üç tarafını keserek bir iyi kültür eklemek hazırlayın. Serti steril cımbızla çıkarın ve poli-L-ornitin ve laminin kaplı bir yemeğin ortasına yerleştirin, ardından yüzeye sabitlemek için kesici ucun kenarına bastırın.
Kesici ucun sıkıca yapıştırılmış olduğunu doğrulamak için kabı dikkatlice ters çevirin ve ultra ince uçlu kalıcı bir karaborsa kullanarak kesici uç bölmesinin sınırını işaretleyin. Nöronal orta ve insan periventriküler endotel hücreleri ve endotel hücreli orta 30 konsantrasyonda insan GABAerjik internöronlar askıya, 70 mikrolitre başına 000, sonra tohum 70 mikrolitre hücre çözeltisi içinde her biri de kültür eklemek. Kesici uç çevresindeki alanı doldurmak ve kaplamanın kurumamasını önlemek için nöron kabına bir mililitre nöronal ortam ekleyin.
Benzer şekilde, periventriküler endotel hücreli çanak için endotel hücreli orta bir mililitre ekleyin. Kesici uç bölmesinden sızıntı olup olmadıklarını doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin, ardından 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le inkübün. Kuluçkadan sonra, hücreleri düzgün bir şekilde taktıklarını doğrulamak için mikroskop altında tekrar kontrol edin.
Tohumlamadan 48 saat sonra, serti steril cımbızla hafifçe çıkarın ve hücre tabakasının bozulmadan kaldığını doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Hem nöron ve periventriküler endotel hücre yemekleri orta çıkarın ve her çanağa taze orta bir mililitre ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle beş gün boyunca kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, orta çıkarın, 10 dakika boyunca% 4 PFA ile hücreleri düzeltmek ve PBS ile üç kez yıkayın. Co-kültür analizi gerçekleştirmek için, askıya 30, 000 GABAerjik interneurons ve 30, 000 insan periventriküler endotel hücreleri co-kültür orta 70 mikrolitre, sonra bir kuyu eklemek bölmesi içinde bu hücre çözeltisi tohum. 48 saat sonra, kesici ucu çıkarın.
Ortak kültürü 5 gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, ortamı çıkarın, hücreleri %4 PFA ile düzeltin ve PBS ile üç kez yıkayın. Kemoterapi-çekim analizi gerçekleştirmek için, bir poli-L-ornitin ve laminin kaplı 35 milimetre lik çanak merkezine üç iyi kültür eklemek yerleştirin, çanak baş aşağı çevirmek ve ultra ince bir ucu ile kalıcı bir belirteç kullanarak kesici orta bölme etrafında sınır işaretlemek.
Tohum 30, 000 GABAerjik internöronlar orta bölmede nöronal orta 70 mikrolitre, daha sonra tohum 10, 000 periventriküler endotel hücreleri ve 10, 000 kontrol endotel hücreleri ve iki dış bölmede kendi orta 70 mikrolitre. Çanak üzerindeki kaplamanın kurumamasını önlemek için yemeğin yan tarafına bir mililitre co-kültür ortamı ekleyin. 48 saat sonra, kesici uçları çıkarın ve hücreleri 37 derece santigrat derecede ve %5 karbondioksitle 36 saat boyunca inkübedin.
Kuluçkadan sonra, ortamı çıkarın, hücreleri düzeltin ve PBS ile üç kez yıkayın. Periventriküler endotel hücreleri ile GABAerjik nöronlar arasındaki etkileşimleri araştırmak için uzun mesafe ve eş kültür göç tahlilleri kullanıldı. Uzun mesafe göç teşbinde hücreler sıfırın üzerinde dikdörtgen bir yama olarak başladılar, ama 48 saat içinde, hücre serbest uzaya göç ettiler.
Anti-Aktif Caspase-3 antikor ile immünositokimyasal boyama, apoptoz bir belirteç, tohumlu nöronlarda hiçbir apoptotik sinyal gösterdi. Eş-kültür göç analizinde, internöronlar insan periventriküler endotel hücreleri ile birlikte tohumlandığında, nöronlar internöronların tek başına tohumlandığında veya kontrol endotel hücreleriyle birlikte tohumlandığında daha uzak mesafelerkat ettiler. Kemo-attraction kontrolünde, periventriküler endotel hücrelerine göre çok daha yüksek sayıda internöron, GABAerjik internöronların periventriküler endotel hücreleri tarafından salgılanan kemo-çekici ipuçlarına seçici olarak yanıt verdiğini doğrular.
Bu tahliller insan internöronlar ile insan periventriküler endotel hücrelerinin etkileşimleri içine mekanistik anlayışlar elde etmek için ligands, inhibitörleri veya tahlil arenes kullanılarak değiştirilebilir. Ayrıca grubumuz ve diğerleri tarafından bildirilen diğer nöral hücreler ile insan periventriküler endotel hücrelerinin etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Bu yordamı denerken, kesici ucu çanak üzerinde sıkıca sabitlemek ve töz boyunca rahatsız edilmeden tutmak önemlidir, aksi takdirde hücre sızıntısına, hücre kopma larına veya kesici uçta çizilmiş sınırla yanlış hizalanmasına yol açabilir.
Çalışmalarımız şizofreni, epilepsi ve otizm gibi psikiyatrik bozuklukların patogenezinde insan periventriküler endotel hücrelerinin hücre özerk rolünü göstermiştir. Bu tahliller bu nedenle IPSC teknolojisini kullanarak bu bozuklukları olan hastalardan elde edilen hastalıklı periventriküler endotel hücrelerinin değerlendirilmesini sağlayacaktır.
