Bu protokol, erken evre pre-antral foliküllerin tek bir sığır yumurtalıktan verimli ve tekrarlanabilir izolasyonuna izin verir ve sığır olmayan bir türde yumurtalık folikülogenezinin incelenmesi için yeni fırsatlar yaratır. Tek bir yumurtalıktan daha fazla sayıda folikül kullanarak, bu teknik yumurtalık hasadından önce in vivo tedavilere veya yumurtalık biyopsisi yoluyla aynı hayvandan zaman içinde birden fazla örneğin tıkanmasına olanak tanır. Erken evre pre-antral foliküllerin izolasyonu ve kriyo-korunması, kemoterapi gibi gonadotoksik tedavi gören genç kadınlarda doğurganlığın korunması ve nesli tükenmekte olan türlerden germplazmanın korunması için değerli bir seçenek olabilir.
Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan doktora öğrencileri olan Stephanie McDonnell, Amanda Morton ve Juliana Candelaria olacak. Başlamak için, laboratuardaki yumurtalıkları Pen-Strep içeren sıcak, steril PBS'ye aktarın ve birçok küçük antral folikülü olan ve belirgin korpus lutetyum içermeyen yumurtalıkları seçin. Fazla bağ dokusunu ve yağları yumurtalıklardan makas kullanarak çıkarın.
Bir yumurtalıktan tezgah kağıdındaki kesme tahtasına aktarın. Bir neşter kullanarak, yumurtalıkları bir bağ bağlantı bölgesinden karşı bağlantı bölgesine uzunlamasına ikiye bölün. Yumurtalıkların bir yarısını işlenecek kesme tahtasında tutun ve yumurtalıkların diğer yarısını Pen-Strep içeren sıcak PBS'ye geri yerleştirin.
Medullayı çıkarmak için, yumurtalık eğriliği boyunca, açıkta kalan medulla yukarı bakacak şekilde korteksten kesmeden yüzeyden yaklaşık 2 milimetre uzağa dilimleyin. Medullanın çoğunluğunu çıkarmak için kesimden aşağı doğru dilimleyin. Yumurtalıkları yarıya çevirin, böylece epitel yukarı bakacak ve medullayı korteksten kesmeyi bitirmek için neşteri kullanın ve bağlara bağlı yumurtalık parçasının kenarı etrafında kalan beyaz bağ dokusunu kesin.
Medullanın çoğunluğu çıkarıldıktan sonra, korteksi yaklaşık 1 milimetre kalınlığa kesmek için neşteri kullanın, neşteri medullanın geri kalanını tıraş etmek için küçük ileri geri hareketlerle manipüle edin, ardından her yumurtalık korteksinin yarısını iki parçaya bölün. Korteks parçalarını doğranmaya hazır olana kadar Pen-Strep içeren sıcak PBS'de tutun. Korteksin tek bir parçasını doku doğrayıcı üzerindeki Petri kabına aktarın ve dokuyu Pen-Strep içeren üç veya dört damla ılık PBS ile ıslatın.
Doku parçasını bir çift forseps ile sabit tutarken, doku doğrayıcıyı başlatmak için Sıfırla düğmesine bir kez basın. Korteksin tüm parçası şeritler halinde kesildikten sonra, bıçağı Petri kabından kaldırmak için bıçak tutucu düğmesini ve bıçaktan herhangi bir dokuyu çıkarmak için forseps kullanın. Plaka tutucuyu 90 derece döndürdükten sonra, tekrar Sıfırla düğmesine basın ve bıçağı tamamen doku şeritlerinden geçirin.
Bıçağı Petri kabından kaldırmak için bıçak tutucu düğmesini ve daha önce gösterildiği gibi bıçaktan herhangi bir dokuyu çıkarmak için forseps kullanın. Bir transfer pipeti ve Pen-Strep içeren sıcak PBS kullanarak, doğranmış dokuyu önceden ısıtılmış 50 mililitrelik konik bir tüpe yıkayın. Doğranmış dokuyu sıcak tutmak için konik tüpü suya veya boncuk banyosuna geri koyun ve doğrama prosedürünü yumurtalıkların diğer üç yarısı ile tekrarlayın.
En iyi kesme sonuçları için, somunu doğrama kolundan çıkarmak ve yıkayıcıyı ve bıçak tokasını çıkarmak için somun sürücüsünü kullanın. Forseps kullanarak, bıçağı doğrama kolundan çıkarın. Kullanılmayan kenar Petri kabına bakacak şekilde ters çevirin ve tekrar doğrama koluna yerleştirin.
Homojenizatör ünitesinin prize takılı olduğundan ve hızın ikinci çubuğa ayarlandığından emin olduktan sonra, 10 milimetrelik jeneratör probunu üreticinin spesifikasyonlarına göre üniteye takın. Ardından, 1 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın ve probu, bir yumurtalıktan doğranmış korteks dokusunu içeren 50 mililitrelik konik tüpe ve tüpü 25 mililitrelik çizgiye doldurmak için Pen-Strep içeren yeterli PBS'ye yerleştirin. Probun yerleştirildiği derinlik, haznenin dibinden ölçülen sıvı yüksekliğinin 1 / 3'ü olmalıdır.
Zamanlayıcı başladıktan sonra, homojenizatörün tabanının boruya temas etmediğinden ve homojenizatör açıkken tüpü sabit tuttuğundan emin olarak homojenizatörü açın. 1 dakikalık homojenizasyondan sonra, probu tüpten çıkarın, ardından forseps kullanarak rotor bıçağı ile rotor tüpü veya korteks parçaları arasındaki boşluktaki havalandırma deliklerini tıkayan bağ dokusunu çıkarın ve tekrar tüpe yerleştirin. Dağınık dokuyu tülbentle kaplı huniye dökün, Erlenmeyer şişesine yerleştirin ve sıcak PBS kullanarak tüpün içeriğini huniye durulayın.
Son olarak, tülbenti ılık PBS ile durulayın. Küçük parçalar halinde sıvıyı, doku parçalarının etrafındaki tülbent etrafında bükerek ve tüm fazla sıvı ve doku tülbentten çıkarılana kadar sıkarak bezin deliklerinden geçmeye zorlayın. Tülbenti huni üzerinde yeniden açtıktan sonra, tülbenti bir transfer pipeti kullanarak Pen-Strep içeren PBS ile durulayın ve tekrar kalan doku parçalarını bezden sıkın.
Bir hemostat kullanarak, 300 mikrometrelik hücre süzgecini 200 mililitrelik bir beher üzerinde tutun ve filtrazı Erlenmeyer şişesine hücre süzgecinden dökün. Hücre süzgeci mendille tıkanırsa, beherin üzerine hafifçe dokunun, ardından süzgeci baş aşağı çevirin ve büyük doku kalıntılarını tezgah kağıdına dokunun. Pen-Strep içeren sıcak PBS kullanarak şişenin içeriğini hiçbir doku parçası kalmayana kadar durulayın ve hücre süzgecine dökün.
Daha sonra, 40 mikrometrelik hücre süzgecini ikinci bir 200 mililitrelik beher üzerinde hemostatlı tutarken, ilk 200 mililitrelik beherde bulunan tüm ilk filtratı süzgeçten dökün, ardından hiçbir doku parçası kalmayıncaya kadar Pen-Strep içeren sıcak PBS kullanarak beherin içeriğini durulayın. 18 gauge iğneyi 20 mililitrelik şırıngaya taktıktan sonra, şırıngayı folikül yıkama ortamı ile doldurun. Bir hemostat ile, 40 mikrometrelik hücre süzgecini kare bir Petri kabının üzerinde baş aşağı tutun ve hücre süzgecinin içeriğini yemeğe yıkamak için şırıngayı kullanın.
Kare Petri kabını, 1,25 ila 3,2x arasında ayarlanmış bir büyütme ile 38,5 santigrat dereceye ayarlanmış sıcak bir sahneye sahip bir stereoskoba aktarın. Kare Petri kabından folikülleri tanımladıktan sonra, mikropipeti kullanarak orta damlaları yıkamak için folikülü aktarın. 6 dakikalık doku homojenizasyonu kullanılarak replikasyon başına izole edilmiş pre-antral foliküllerin toplam sayısı, replikasyon başına ortalama 41 folikül olduğunu ve 11 ila 135 folikül arasında değiştiğini göstermektedir.
476 izole folikülün gelişim aşamasının değerlendirilmesi, çoğunluğun gelişimin birincil aşamasında olduğunu ve bir kat küboidal granüloza hücresi içeren 40 ila 79 mikrometreyi ölçtüğünü göstermiştir. Yumurtalık korteksinin 6 dakika boyunca homojenizasyonu, aynı hızda 5 dakikalık homojenizasyona kıyasla daha fazla sayıda pre-antral folikül verdi. Foliküllerde granüloza hücre belirteci FSH reseptörü ve germ hücre belirteci DAZL'ın transkript ekspresyonu, hem primer hem de erken sekonder foliküllerin FSH reseptörü ve DAZL transkriptlerini eksprese ettiğini gösteren ters transkripsiyon kantitatif PCR kullanılarak değerlendirildi.
CX37'nin izole pre-antral foliküllerde hem primer hem de erken sekonder evrelerde immünofloresan lokalizasyonu, CX37'nin O bölgesinin çekirdeğinde ve granüloza hücrelerinin zarında bulunmayarak O plazmasına lokalize olduğunu göstermektedir. Deneyimlerimize göre, ince bir kortikal doku tabakasının uygun şekilde diseksiyonu, dokunun doğru boyutta kesilmesi ve uygun homojenizasyon, canlı foliküllerin dokudan salınmasını sağlamak için kritik adımlardır. İzole pre-antral foliküller, pre-antral folikül büyümesinin düzenlenmesi ve granüloza hücreleri ile oosit arasındaki etkileşimlerin doğası gibi soruları cevaplamak için kullanılabilir, böylece daha verimli kültür koşullarının gelişimini kolaylaştırır.
