Bu çalışma NIH hibe R01 DK060581, R01 DK083583 (RGM hem) tarafından kısmen desteklenmiştir.

A. Malzeme İhtiyaç: Tablo 1 (reaktifleri) Bkz hazırlanmasından önceki <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 +% 1 penisilin / streptomisin (buzdolabında saklanan veya buz üzerinde tutulmalıdır). </li><li> % 20 BSA stok su içinde yapılmış ve bölünüp ve -20 ° C&#39;de depolanır </li><li> HBSS (BSA): 1X 200 ml HBSS (P / S)% 20 BSA + 3 ml (nihai konsantrasyonlar BSA,% 0.3 &#39;tür) </li><li> Adacık orta: RPMI +% 10 FBS +% 1 glutamin +% 1 penisilin / streptomisin </li><li> Histopaque 1100: 1119, 240 ml Histopaque + 200 mL 1077 Histopaque </li><li> 4-0 Sütür (McKesson): 2 ¾ inç parçalar halinde kesilir ve 10 cm Petri saklanır </li><li> Araçlar: 90 ° Güzel Bilim Araçları forseps bükün ve forseps her üç çift dişli diş aşağı dosya. Amacınız onları kaldırmak için değil, sıkıcı dişleri için. </li><li> Kollajenaz / proteaz karışımı yönetimi için Kanül: 27G ½ iğne inç, 30 ½ inçiğne, PE50 boru parçaları 12 inç kesti. Keskin kenarları yumuşak bir yuvarlak sonuna kadar her iki iğne aşağı Dosya. PE50 boru parçası içeri bir 12 bir ucunun içine 27G iğne takın. Kasa dönüm, bir pense ile gövde kırarak kasasından 30G iğne çıkarın ¼ her zaman açın. Kasasından pense ile iğne çıkarın ve diseksiyon mikroskop altında PE50 boru diğer ucunu takın. Eğer PE50 boru içine iğne eklemek gibi tüp bükmeyiniz emin olun. 27G iğne Eğer kollajenaz şırınga takmak olacağı sonudur. </li><li> Kollajenaz (CI zyme MA) ve Nötr Proteaz (CI zyme BP). Üreticinin talimatlarına göre sulandırın TDE. Enzim aktivitesi konsantrasyonu hesaplamak için Analiz sürü belirli Sertifikası bakın. Sulandırılan kollajenaz 350,000 kollajen aşağılayıcı aktivitesi (CDA) birimleri ve reconstit 100.000 nötral proteaz adet toplam aktarınuted BP konik bir tüp içine Proteaz ve HBSS 15 ml&#39;den (P / S) kadar seyreltmek </li></ol> B. Adım Adım Protokolü 1. Kollajenaz / Proteaz Karışımı ile Pankreas Enflasyon <ol><li> Servikal dislokasyon ile fare Euthanize,% 70 EtOH, herhangi bir diseksiyon makas ve forseps ile tamamen anüsten diyafram açık karın boşluğu ile fare gövde doyurabilecek. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu platformu üzerinde fare yerleştirin. </li><li> Çekum ve çıkan kolon çekin ve sol vücut boşluğuna dışında onları ayarlayın. Aşağıdaki adımlar bir özeti için Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> Diyafram karşı karaciğer lobları yerleştirin; vücut boşluğuna yeterince açıksa orada kalmalıdır. Hepatik arter, portal ven ve kavisli bir forseps ile onikiparmak kavrayarak karaciğere giden safra kanalı paket bulun. Kavisli bir forseps bir çift ile, arter, ven altına ulaşarak, ve kanal metndle ve arter, ven, safra kanalı altında 4-0 sütür parçası içeri ¾ 2 çekin ve bir kez kravat ve mümkün olduğunca karaciğer yakın sıkı çekin. </li><li> Kavisli bir forseps iki çift kullanarak, dikkatle duodenum kapmak ve papillada duodenuma bağlı safra kanalı bulabilirsiniz. Papilla için safra kanalı yakın altında pankreas ve bağ dokusu hakkı yoluyla poke forseps bir maşa kullanın. Bir delik yapmak organı aracılığıyla hızla forseps Poke ve sonra forseps hem maşa aracılığıyla koymak ve 4-0 sütür başka 2 ¾ inç parça kapmak yoluyla ve kravat kez ve küçük bir daire için çekin, ama sıkı çekmeyin. </li><li> 90 ° forseps ve Superfine Vannas makas değiştirin. 90 ° forseps ile dikkatlice tutun ve safra kanalı gergin olana kadar ince bağırsak çekin. Bağırsak içine açık makas bıçaklama ve sonra bir hareket ile keserek makasla papilla çapında bir yatay kesim olun. Sadece o yapmaya çalışınne papilladan koledok oradan çıkarmadan papilla genelinde kesti. </li><li> Hala 90 ° forseps ile bağırsak tutarken, safra yolu uzunluğunun yarısı kadar safra kanalı içine kanül takın ve ardından yavaşça kanülün etrafında sıkı dikiş çekin. </li><li> Kollajenaz / proteaz karışımı 2.0 ml 3 ml şırınga doldurun ve yavaş, sabit bir hızda kanül içine enjekte edilir. </li><li> Pankreasın enflasyon tamamlandıktan sonra, safra kanalı arasından kanül kaldırmak ve inen kolon başlayan ve bağırsak yukarı çekin gibi bağ dokusu kırpma tarafından şişirilmiş pankreas kaldırmak için kavisli bir forseps ve kavisli makas makas kullanın. Eğer safra kanalı ulaşana kadar bağırsak, pankreas kaldırmak için devam, sonra, dalak, mide, pankreas kaldırmak ve sonra karın boşluğu organları gelen. Sütürler uzak kırpma kaldırarak bitirin. HBSS 5 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüpe pankreas ekleme(P / S). Bu boru, buz üzerinde olmalıdır. </li><li> Dört hayvanlara her hayvan için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. En iyi sonuçlar için, tek seferde sadece dört pancreata çözerler. Ilk dört 37 ° C su banyosu içinde iken Tipik olarak, bir başka dört pancreata şişirmek. </li></ol> 2. Pankreas Ayrılma <ol><li> 15 dakika için bir 37 ° C su banyosu içine pancreata ihtiva eden 50 ml&#39;lik tüplere yerleştirin. </li><li> Yavaşça tüp kaya ve doku disosiyasyon kontrol için kapağı tarafından tüpü tutarak iken doku tüpler girdap sonra kolayca ayrı 12 kez gelir emin olun. </li><li> Bir dakika boyunca 290 xg&#39;de en fazla 30 HBSS (BSA) (bu adım için santrifüj tüpleri dengelemek için gerekli olan ne kadar bağlı olarak, daha düşük bir miktar olabilir) ml ve santrifüj ekleyin. </li><li> Süpernatant dikkatlice aspire ve hücre peleti bozmayacak şekilde alt süpernatant (2-3 ml) küçük bir miktar bırakın. </li><li> 30 ml şırınga attac kullanma14G iğne hed, HBSS (BSA) ve en fazla 10 ml ekleyin ve 2 kez aşağı süspansiyon aspirat ve. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine plastik bir çay süzgeci yoluyla hücre karışımı süzün ve başka bir 10 ml HBSS (BSA) ile yıkayın. </li><li> 2 dakika süreyle 330 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Durusu süpernatant ve 1 dakika için bir emici kağıt havlu üzerine drenaj boruları ters. </li><li> 10 ml soğuk 1100 histopaque her bir tüp içinde yeniden süspanse edin. </li><li> 10 ml HBSS (BSA) ile histopaque kaplaması ve 18 dakika için 900 x g&#39;da santrifüjlenir. </li><li> Büyük bir delik 25 ml pipet kullanarak süpernatant genelinde 20 ml çıkarın ve filtre ters 70 mikron ile süpernatant geçmek. </li><li> Yemeğin üzerine sağ tarafı yukarıda tutarak filtre ile 10 ml adacık medya pipetleme 10 cm Petri kabı içine adacıklar durulayın. </li><li> Deney için hazır olana kadar bir kültür 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe islets. Tipik olarak, adacık el-aldı ve önceki exper kadar saydımimentation. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Islet verimleri, morfolojisi ve kalitesi adacık izolasyonu başarı yargılamak için kullanılan genel parametrelerdir. Bizim eller, ortalama C57BL / 6 fare adacık verimleri bu protokolü (bkz. Tablo 2) kullanılarak 150-250 adacıklar aralığında ve optimize Sigma tip XI kollajenaz kullanılarak elde edilen veriler karşılaştırılabilir. Ancak, verimleri kullanılan fare zorlanma ve fare yaşına bağlı olarak değişebilir. Biz istihdam hayvanların çoğu 8-16 hafta yaş aralığındaki Bu protokol C57BL / 6 (180-250 adacıklar / fare), CD1 (200-300 adacıklar / fare), 129 / dahil olmak üzere, birden fazla fare suşları üzerinde test edilmiştir vardır B6 (200-300 adacıklar / fare), BLKS-db/db (120-200 adacıklar / fare), NOD (10 haftalık, 100-150 adacıklar / fare), ve NOD-SCID (100-150 adacıklar / fare ). Tipik adacık morfolojisi (adacık nispeten homojen bir boyut ile şekil dikdörtgen bir yuvarlak sahip olduğu, Şekil 2 &#39;de gösterilen boyut UNIF rağmenormity) zorlanma gerginlik değişebilir. Şekil 3 saflaştırılmış TDES vs Sigma tipi XI kollajenaz ile C57BL / 6 fare izole adacıklar glikoz ile uyarılan insülin salgısının bizim tipik analizini gösterir. Tipik olarak, 2.5 mM glikoz de gözlenenden daha 6-20 kat daha fazla olan, 25 mM glikoz bir insülin uyarım yüksek kaliteli adacık hazırlama sonuçlanır. Diğer uygulamalar da izole adacıklar kalitesini test etmek için kullanılan ve bu perifusion teknikler, diğerleri arasında 11. Ca2 + görüntüleme (Fura2 ile) ve ters transkripsiyon-PCR kullanılması dahil edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Koledok kanülasyonu bir özeti. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. 24 saat aşağıdaki yalıtımı konusunda C57BL / 6 adacıktan tipik görünümü. Görüntüler içinde yakalanmaları40X büyütmede verted mikroskop. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. C57BL / 6 adacık glukoz-uyarılmış insülin salgılanması. 24 saat aşağıdaki izolasyon olarak, 100 adacıkları 37 2.5 mM glükoz ihtiva eden Krebs-Ringer ° C HEPES-tamponlu çözelti, 1 saat boyunca bir 12-kuyu çanak içinde inkübe edildi. Adacıkları ardından iki sitenin immunospecific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Kristal Kimya) kullanarak süpernatant insülin ölçümü için toplandı sonra ek bir saat için 2.5 mM glukozun Krebs-Ringer HEPES aktarılmıştır. Aynı Adacıklar daha sonra 25 mM glükoz ihtiva eden Krebs-Ringer HEPES-tamponlu çözelti ile transfer edildi ve ortam içine insülin salınması inkübasyondan 1 saat sonra ELISA ile ölçülmüştür.

<ol>
	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDS, SAT ve RGM ifşa hiçbir şeyim yok. Yazar AGB VitaCyte tarafından istihdam edilmektedir. Yazar RCM VitaCyte bir mülkiyet çıkarı vardır.

Bu protokol, Langerhans adacıkları izole amacı ile, kanülasyon, kollajenaz perfüzyon ve fare pankreas ayrışması için prosedürü tarif var. Teknik olarak, bizim yöntemi, bir kez hakim, hayvan ötenazi 4 dk içinde pankreas izolasyonu için izin vermeli, ve 1 saat tek bir hayvandan adacık izolasyonu sonuçlanmalıdır. Tekniğin hız bize böylece 3.000 adacıklar için bir izolasyon ile sonuçlanan kadar, tipik bir streç 12 fareler için adacıkları izole etmek için olanak sağlar. Kollajenaz ham preparatları kullanan diğer protokoller aksine, bizim protokol saflaştırılmış proteazlar, CI zyme Kollajenaz MA ve CI zyme BP Protease kullanımı sunmaktadır. Ticari olarak temin edilebilirler TDE preparatlar tutarlılık varyasyonlar her bir çok ayrı ayrı genel kullanım öncesinde test edilmiş ve optimize edilmiş olmasını gerektirir. Bu çok-to-çok değişkenlik bize puri kullanımı dikkate yol açtıVitaCyte dan ğı TDES. Bunlar, yüksek oranda saflaştırılmış TDES duyarlı fluoresan etiketli substrat testlerinin kullanılması da dahil olmak üzere birden fazla yöntem ile karakterize edilir. Floresans CDA tahlil aşağılayıcı yerli kollajen farklı kinetik var kollajenaz farklı moleküler formları daha duyarlıdır. Tarihsel peptid substrat testlerinin kollajenaz tamamlanmamış bir değerlendirmesini sağlar. Birden yöntemlerle kollajenaz niteleme sürü arasında büyük enzim aktivitesi sağlar. Piyasada bulunan kollajenaz hazırlıkları çeşitli kullanarak bizim in-house test dayanarak, saflaştırılmış enzim kombinasyonları tekrarlanabilir sürü-için-lot sonuçları verdiğini bulundu. Bu uygulama son derece saf ve titizlikle karakterize TDES kullanmanın önemli avantajları kez Optimum enzim yapısı tanımlanmaktadır olan, çok-to-lot performans tutarlılığı sağlanır. Bu tutarlılık normalde gerekli yeri yeterlilik emek yoğun bir süreç ortadan kaldırırham veya zenginleştirilmiş kollajenaz ürünler için. Saflaştırılmış TDES da farklı fare suşları kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için kompozisyonun ek değişiklikleri etkinleştirmek. Farelerin farklı suşları adacık izolasyonu için optimum enzim bileşimler, raporlanması daha etkili bir şekilde iletişim olabilir. Bu da, kaynaklar ve deneysel tasarım geliştirilmiş esneklik daha verimli kullanımına yol açmaktadır. Bizim protokolü kullanılarak adacık izolasyonların sonucunu etkileyebilecek birçok kritik adımlar vardır. Birinci enzim hazırlanması perfüzyon sırasında pankreas etkili şişirme elde etmek için ihtiyaç vardır. Bu şırınga üzerine nazik bir güçle enflasyon başlatın ve pankreas açılırsa olarak kuvvetini artırmak için önemlidir. Bu bağırsak hareket ve kollajenaz tüm organı perfuses böylece enflasyonun sırasında pankreas kaldırmak için yardımcı olur. Başka kritik adım biri tüpler afte sallar hangi ile güçtür37 ° C (adım 2.2) de r inkübasyon. Bu tüp kapak karşı sert pankreas sallama adacık parçalanma neden olur, ancak bu aşamada mekanik ayrışma herhangi bir biçimde, adacık verimleri önemli ölçüde düşmesi bulduk. Bu şırınga (adım 2.5) ile ayrışma basamağı sırasında, bir orta-düzey kuvvet ile piston yukarı ve aşağı doğru hareketi sırasında uygulanan da çok önemlidir, bu filtreleme adımı (2.6) daha önce yeterli doku çözünme sağlar, burada çok az doku çay süzgeci filtre üzerinde saklanmalıdır. Son olarak, dikkatle takip etmek son adım histopaque fraksiyone adacık genelinde 20 ml aspirasyon olduğunu. Adacıklar histopaque ve HBSS ve arayüzü tipik olmasına rağmen, biz sadece arayüz kaldırmaya çalıştığınızda biz adacıklar kaybetmek bulduk, bunun yerine, artık büyük bir delik 25 ml pipet kullanarak tüm 20 ml çıkarın. Biz c ihtiyacını ortadan kaldırmak için ters 70 mikron filtre (adım 2.11) aracılığıyla filtrasyon eklendihistopaque uzak yıkamak için art arda adacıklar entrifuge.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td></td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> herhangi </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 Sütür 100 yd rulo </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g kör uçlu iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vannas Superfine sciss </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli Bahar Makas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli Forseps (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli forseps (90 °) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 inç iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2 inç iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE boru </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Proteaz </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml şırınga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml&#39;lik şırınga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um bir filtreden </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Petri Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik çay süzgeci </td><td> Herhangi bir mutfak tedarik </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Reaktifler ve Ekipmanları </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma tipi XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110.329) </td><td> MA (081104) BP (100.823) </td><td> MA (091.211) BP (101.109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Farklı TDE sürü kullanarak * Tablo 2. Ortalama adacık verimleri (± SD) * Veriler, en az 10 farelerin ortalama adacık verimi temsil eder. Parantez içindeki Lot numaraları </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

Beta hücre gen ekspresyonu ve in vitro fonksiyon sorgulama dürüstçe kemirgen tümörojenik hücre hatları çalışma izole kemirgen adacıklar çalışması için yılda kaymıştır. Birincil adacıkları daha sadakatle hücre içi sinyal yolları ve sekretuar yanıtları biyoloji yansıtan ayrı bir avantaj sunuyoruz. Doku dissociating enzim (TDE) preparatlarını kullanan adacık izolasyon yöntemi de birçok laboratuvarlarında 1-4 kurulmuştur Oysa, herhangi bir kemirgen gerginlik adacık verim ve kalite tutarlılığı farklılıklar ölçüde ve birincil adacık çalışmalar fizibilite sınırlayabilir. Bu varyasyonlar, sık sık adacık izolasyon prosedüründe kullanılan ham kısmen saflaştırılmış TDES bir sonucu olarak ortaya çıkar; sık sık aktivitesi çok arası çok varyasyonları gösteren ve sık sık kullanılan enzim doz ayarlamaları gerektirir TDES. Raporlar az sayıda kemirgen hücre izolasyonları için TDES 5, 6 saflaştırılmış kullanmış </sup&gt;, ama pratikte insan adacık izolasyonları için TDES saflaştırılmış rutin kullanımı ve avantajları rağmen yaygın değildir. VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN) ile işbirliği içinde, biz yoluyla ham doku fraksiyonasyon takip TDES farelerin pankreatik kanal içine doğrudan perfüze edildiği Gotoh 7, 8, tarafından tarif dayalı bir modifiye fare adacık izolasyonu protokolü geliştirdi Bir Histopaque gradiyent 9, ve adacıklar saflaştırılmış izolasyonu. Bizim protokol anlamlı bir fark saflaştırılmış kollajenaz (CI zyme MA) ve nötr proteaz (CI zyme BP) kombinasyonunun kullanımıdır. Kollajenaz substrat 6 olarak floresan etiketli çözülebilir buzağı cilt fibrillerin yararlanılan 6 floresans kollajen aşağılayıcı aktivitesi (CDA) testinin kullanımı ile karakterize edilmiştir. Bu substrat olarak yerli kollajen dayanır çünkü bu substrat doku matriksinin kollajen bozunma kinetiği daha prediktif olduğunu. Proteaz CH olduğuhassas bir floresan kinetik yöntemde 10 ile aracterized. Daha geleneksel biyokimyasal analizi ile birlikte bu gelişmiş testlerin kullanılması TDE lotlar arasında gelişmiş performans tutarlılığı yol daha tutarlı üretilmesini sağlayacak. Burada açıklanan protokol C57BL / 6 fareler kullanılarak maksimal adacık verimi ve en uygun adacık morfoloji için optimize edilmiştir. Bu protokolün geliştirilmesi sırasında, kollajenaz ve nötral proteazların çeşitli kombinasyonları farklı konsantrasyonlarda değerlendirilmektedir ve kollajenaz nihai oranı edildi: 35:10 nötral proteaz Sigma Tip XI karşılaştırılabilir enzim performansını gösterir. Sıçan ve farelerin farklı suşları ortalama adacık verimlerinde önemli değişkenlik bildirilmiştir Çünkü, TDE kompozisyonun ek değişiklikler farklı tür ve suşlarının kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için yapılmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease at JoVE.com

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K Görüntüleme.  Indiana University School of Medicine. Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.

Video: Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Biyoloji

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...