Bu yöntem, vücuttaki sağlıklı ve hastalıklı dokularda bulunan model ortamlarına kontrollü lif hizalama seviyelerine sahip 3D kollajen hidrojelleri tasarlamamızı sağlar. Bu teknik, hizalanmış kollajen hidrojellerini tasarlamak, hücreleri tanıtmak ve hücrelerin topografik olarak tanımlanmış 3D ortamlarda nasıl davrandığını ölçmek için basit bir mikroakışkan yaklaşım sağlar. Prosedürü laboratuvarım için Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly ve Justin Vidas gösterecek.
Başlamak için, 250 mikrometre kalınlığında bir PDMS levhayı plastik bir taşıyıcıya monte edin ve tıraş bıçağı, 0,5 milimetre bıçak derinliğinde, saniyede bir santimetre hızda ve yüksek kuvvette bir zanaat kesici kullanarak mikroakışkan tasarımı kesin. Ultrasonik bir banyo kullanarak, mikroakışkan kanal kesiklerini beş dakika boyunca temizleyin. Sonikasyonlu kanalları deiyonize suda durulayın ve beş dakika boyunca 100 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde kurutun.
Kanalları kullanana kadar temiz, kapalı bir Petri kabında saklayın. PDMS kapak tabakasını imal etmek ve yüzeyi gelecekteki modifikasyonlar için işlevselleştirmek için, 49 mililitre asetona bir mililitre aminopropil trietoksisilan ekleyerek bir cam beherde% 2'lik bir aminopropil trietoksisilan çözeltisi hazırlayın. Daha sonra,% 25'lik bir glutaraldehit çözeltisini% 5'e seyreltin.
Her 24 milimetre x 50 milimetre kapak kayması için iki mililitre çözelti yapın. IPA kullanarak kapak fişlerini banyo sonikatöründe beş dakika boyunca temizleyin. IPA'yı deiyonize su kullanarak kapak fişlerinden durulayın.
Kapak kayması üzerindeki pürüzsüz bir su filmi, IPA'nın iyice durulandığını gösterir. Kapak kaymalarını sıcak bir plaka üzerinde 100 santigrat derecede beş dakika kurutun. Kurutulmuş kapak fişlerini temiz Petri kaplarına yerleştirin ve üst üste binmemelerini sağlayın.
Bir korona boşaltma değneği kullanarak, kapak kaymalarını her biri bir dakika boyunca bir korona deşarjına maruz bırakın. Korona maruziyetinden sonraki beş dakika içinde kapak fişlerini çıkarın ve her kapak kaymasını 10 saniye boyunca aminopropil trietoksisilan çözeltisine batırın, kapak kaymasının suya batırıldığından emin olun Ardından, kapak kaymalarını aminopropil trietoksisilan çözeltisinden çıkarın, 10 saniye boyunca asetona daldırın ve basınçlı hava ile kurutun. Kuru kapak kaymasını Petri kabına geri yerleştirin, tedavi edilen taraf yukarı bakacak şekilde.
Her kapak kaymasının yüzeyine bir mililitre glutaraldehit çözeltisi pipetin. Çözeltinin kapak kaymasının kenarına dökülmesine izin vermeden mümkün olduğunca fazla yüzeyi örtün. Kapak kaymalarının 30 dakika boyunca çözelti ile temas etmesine izin verin ve ardından 20 saniye boyunca deiyonize suyla durulayın.
Kapak fişlerini basınçlı hava kullanarak kurutun ve plazma ile işlenmiş tarafı yukarı doğru Petri kaplarına geri yerleştirin Modüler manyetik tabanı lazerle kesmek için, geçiş sayısı ve güç gibi uygun lazer ayarlarını kullanarak tasarımları PMMA katmanından kesin. Lazer ayarları, mıknatıslar PMMA katmanına preslenebilecek şekilde ayarlanmalıdır. Lazer kesim işlemindeki kalıntıları gidermek için lazerle kesilmiş kısmı sabun ve su kullanarak yıkayın.
Solvent kullanmayın, çünkü lazerle kesilmiş kenarlarda mikro çatlaklar yayabilirler. Platformu monte etmek için, mıknatısları elle lazer kesim tabanına itin. Mıknatısların kalınlığı, mıknatısların tabanın yüzeyi ile aynı hizada olmasını sağlamak için PMMA tabanının kalınlığından daha az olmalıdır.
Basıncı hassas yapıştırıcıdan veya PSA tabakasından desteği çıkarın ve tabanı, işlevselleştirilmiş tarafı yukarı bakacak şekilde glutaraldehit ile muamele edilmiş bir kapak kaymasına takın. PDMS kanal kesimini çerçeve tarafından tanımlanan boşluğa yavaşça yerleştirin. Hava kabarcıklarını çıkarmak ve konformal temas sağlamak için geniş uçlu cımbızla bastırın.
Sığır serum albüminini veya BSA ile muamele edilmiş kanal kapağını, BSA tarafı aşağı bakacak şekilde kanal kesiğinin üstüne yerleştirin. Sıvı giriş ve çıkış portlarının kanalla aynı hizada olduğundan emin olun. Cihaz kollajen I enjeksiyonu için hazırdır.
Bir biyogüvenlik kabinine bir şırınga pompası, soğutulmuş steril bir şırınga, soğutulmuş nötralize edilmiş kollajen I çözeltisi ve steril bir 20-gauge 90 derece açı uçlu luer kilit iğnesi yerleştirin. Kollajen I solüsyonunu şırıngaya yükleyerek kabarcıklardan kaçının. İğne ucunu şırıngaya takın, şırıngayı şırınga pompasına, iğne aşağı bakacak şekilde yükleyin ve iğneyi kollajen I çözeltisi ile astarlayın.
Şırınga pompasını dakikada 50 ila 2.000 mikrolitre arasında gerekli akış hızına ayarlayın. Hazırlanan PDMS kanallarını bir laboratuvar jakına yerleştirin ve iğne ile düzleştirin. İğneyi PDMS kanalının giriş portuna yerleştirin.
Çıkış tarafında topladığım 30 mikrolitrelik bir kollajen damlasına kadar kanala enjekte edin. Laboratuvar jakını indirin ve iğneyi yeni doldurulan kanaldan yavaşça ayırın. Tüm kanallar kollajen I çözeltisi ile doldurulana kadar tekrarlayın.
Yeni oluşan kollajen I jelinin dehidrasyonunu önlemek için doldurulmuş kanalları Petri kaplarına deiyonize suyla doyurulmuş temiz, tüy bırakmayan bir mendille birlikte yükleyin. Petri kabını örtün ve yüklü kanalları soyma adımından önce iki saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Soyulma ve ortam dengesi için, polimerize kollajen I jelini açığa çıkarmak için cımbız kullanarak PDMS kapağını kaldırarak başlayın.
Kuyuya 650 mikrolitre endotel büyüme ortamı ekleyin. Alternatif olarak, ek bir kollajen tabakası tanıtmak veya ortam perfüzyon yetenekleri sağlamak için başka bir modül takın. Jeli ve ortamı dengelemek için cihazları inkübatörde en az dört saat bırakın.
Hücrelerle tohumlamadan önce ortamı değiştirin. Cam kapağın kaymasını etkinleştiren kanalın kaldırılmasını ve PDMS kapağının BSA ile işlevselleştirilmesi kollajen I yapışmasını önledi. Kollajen I lif hizalaması, kapağı kaldırdıktan sonra etkilenmeden kaldı.
Matrisin hizalanmış segmentinde kültürlenen HUVEC'lerin görüntüleri, rastgele liflere sahip segmentteki HUVEC'lere kıyasla artmış aktin lifi hizalaması gösterdi. Yaklaşımımız, tümör mikro ortamını modellememize ve farklı hücre tiplerinin nasıl tepki verdiğini ölçmemize olanak tanır. Uzun vadeli deneyleri desteklemek için akış kanallarını da tanıtabiliriz.
