Name: planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.

1. 3D Kalıp Tasarımı ve Parçaları <ol><li> Kalıp <ol><li> Çalışmaya başlamadan önce, bir silikon elastomer kiti, bir canlı hücre görüntüleme odası, 22 mm cam lamel ve boyutları 10.07 mm x 3.95 mm x 5.99 mm ile işlenmiş alüminyum metal küp edinin. Alt tutucu lamel yerleştirerek ve satıcı tarafından yönlendirildiği gibi odasının kalanını montaj döküm için canlı hücre görüntüleme odası hazırlayın. </li><li> Sonra, forseps kullanarak, canlı hücre görüntüleme odası konut ortasında ve lamel üstüne işlenmiş alüminyum metal küp yerleştirin ve sonra bir kenara koyun. </li><li> Elastomer 5 ml yapmak için, üreticinin protokolüne uygun olarak, silikon elastomer çözüm karıştırın. </li><li> Tek kullanımlık laboratuar spatula kullanarak, canlı hücre görüntüleme odası kurulum içine silikon elastomer çözüm dökün ve yerleştirilen işlenmiş alüminyum metal küp taşımak için değil emin olun. Kür için güvenli bir yer O / N, laboratuar bankta sistemi yerleştirin. </li><li> Ertesi sabah, deconstructCanlı hücre görüntüleme odası, üretici tarafından önerilen ve forseps kullanarak kalıp çekin. Forseps kullanarak, dikkatli bir kalıptan işlenmiş alüminyum metal küp ayıklayın. Lavaboya gidin ve deiyonize su ile kalıp durulayın. Kurutmak için kağıt havlu üzerine kalıp yerleştirin. </li><li> Kuruduktan sonra, bir hobi maket bıçağı kullanılarak, kalıp yarıklar kesme silikon kalıbın içinde, her bir uzunlamasına ucundan 2.34 mm aralıklı. Eğer bir deney için sistem inşa hazır olana kadar güvenli ve kuru bir yerde kalıp kalır emin olun. </li></ol></li><li> Hidrofilik ve hidrofobik Cam Lameller Hazırlık <ol><li> Kolajen matrisi, bir yüzeye yapışır hidrofil lamelleri oluşturmak için izin vermek için: <ol><li> Tek kullanımlık bir pipet kullanarak, 3-aminopropil-trimetoksisilan, 150 ul ölçmek ve 50 ml&#39;lik bir tüp içinde çözelti dökün. İkinci bir pipet ile 50 ml tüp% 100 etanol içinde 30 ml ilave edilir ve kapağı kapatın. Tüm karıştırma sağlanması, 2 dakika için çözelti vorteksleyin. PBizim cam Petri kabındaki solüsyonu ve bir kenara koyun. </li><li> İkinci Petri kabındaki% 100 etil alkol 15 ml dökün ve kenara (yemekleri etiket emin olun). </li><li> Yeni bir atılabilir pipet kullanılarak, deiyonize su içinde 30 ml ölçmek ve 50 ml&#39;lik bir tüp içine dökün. Sonra, glutaraldehit 1.875 ul yeni atılabilir pipet ölçü dışarı kullanarak ve aynı 50 ml tüp içine çözüm dökün ve kapağını kapatın. Tüm karıştırma sağlanması, 2 dakika için çözelti vorteksleyin. Üçüncü Petri kabı içine karışımı dökün ve bir kenara koyun. </li><li> Forseps kullanarak, tek 22 mm yuvarlak cam lamel çıkar ve tek kullanımlık pipet kullanarak% 100 etanol karışımı ile her iki tarafı durulayın. </li><li> % 100 etanol çözeltisi çanağı 30 ml 3-aminopropil-trimetoksisilan içine durulanmış cam lamel yerleştirin ve 5 dakika boyunca çözelti içinde bekletin. </li><li> Forseps ile cam lamel çıkarın ve tek kullanımlık pipet ile% 100 etanol çözeltisi ile tekrar yıkayın. </li><li> 1875 içine durulanır cam lamel BırakGlutaraldehid ul 30 deiyonize su karışımı içinde çözdürülür ve 30 dakika için bir kenara. </li><li> 30 dakika sonra, forseps ile cam lamel çıkarın ve iyonu giderilmiş su ile durulayın ve oda sıcaklığında kurumaya kuru ince dokulu O / N üzerine yerleştirin. </li><li> Tekrarlayın lamel daldırma ve aynı oluşturulan çözümleri ile gerektiği kadar lamelleri için hareket. </li></ol></li><li> Verilen protokol hidrofobik lamelleri sağlayın. <ol><li> Tridekaflor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl 500 ul asetik asit, 100 ul, 2 dakika boyunca 50 ml&#39;lik bir tüp ve girdap içinde, heksan içinde 19.4 ml ekleyin. Cam Petri kabındaki solüsyonu dökün ve bir kenara koyun. </li><li> Temiz forseps kullanarak, tek cam lamel almak ve 2 dakika için hazırlanan karma çözüm içine bırakın. 2 dakika geçtikten sonra, forseps ile cam lamel çıkarın ve oda sıcaklığında kurumaya kuru doku O / N üzerine atılan bir pipet ve yer lamel kullanılarak deiyonize su ile durulayın. Kullanılıncaya kadar plastik Petri kapları saklayın lamel. </li><li> Tekrarlama lamel DIPPing ve aynı oluşturulan çözümleri ile gerektiği kadar lamelleri için hareket. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Kalıp Montaj <ol><li> Tek kullanımlık pipet bir kimyasal atık konteyner üzerinde% 90 etil alkol ile kalıp durulayın kullanarak kalıplar kullanmadan önce. Daha sonra, iyondan arındırılmış su ile dolu bir Petri kabındaki kalıp yerleştirmek ve O / N bekletin. </li><li> Kalıp aksamını başlamadan önce kuru hava bir havlu üzerine forseps ve yer kullanarak çözümün dışında kalıp atın. </li><li> Kalıp hava kurutma iken, yüksek hassasiyetli elmas lıklar aracını kullanarak x 5.99 mm 3.95 mm&#39;den biraz daha büyük iki dikdörtgen içine kare hidrofil lamelleri kesti. Silikon kalıp halinde kesilmiş yuvalarına her kesim dikdörtgen lamel kaydırın. </li><li> Baş aşağı çevirin ve kalıp tek kullanımlık pipet kullanarak silikon kalıp alt kısmındaki vakum gres sürün. Sonra, arka sağ taraftaki yukarı kalıp çevirmek ve dairesel hidrofil cam kapaklar üzerine kalıbın alt basınBir mühür oluşturmak için dudak. </li><li> Tek kullanımlık eldiven ile monte kalıp pick up ve tek kullanımlık Petri kabı içine ve daha sonra bir biyo-kaputun içine yerleştirin. Deneme oluşmadan önce kalıp sterilize etmek için 1 saat UV Bio-luk lamba açın. </li></ol> 3. Kolajen Karışımı ve 3D Matrix <ol><li> Kollajen karışımı, leke hazırlama ve standart protokoller 28 göre görüntülenmesi için hücreleri hazırlamak önce. </li><li> Bir biyo-başlığı içinde, standart laboratuvar teknikleri ve protokolleri 29,30 kullanarak, istenen kimyasal çekici madde konsantrasyonu 15 ml&#39;lik bir tüp içinde, hücre ortamı ve kemoatraktan karıştırın. Pipet 5, bir 15 ml tüp içine spesifik hücre ortam kemoatraktan konsantrasyonu solüsyonu ve ısıtılmış bir su banyosu içine solüsyon hareket ettirin. </li><li> Bir pipet kullanarak, mikroskopi deneyleri için çözeltiyi ısıtmak için bir ısıtılmış su banyosu içinde, ikinci bir 15 ml tüp ve yerine, sadece hücre medya 5 ml ekstrakte edin. </li><li> 10x fosfat tampon, bir biyo-kaput, pipet 30 ulmikro santrifüj tüpüne ed çözeltisi (PBS). 15 saniye için aynı mikro santrifüj tüpü ve girdap içine 1 N sodyum hidroksit (NaOH), 6 ul ekleyin. </li><li> Buzdolabından kollajen I sıçan kuyruğu çözümü edinin ve standart laboratuar teknikleri ve protokolleri 29 kullanılarak biyo-kaput taşıyın. Kollajen hala soğuk olduğundan emin olun. Aynı mikro santrifüj tüpüne kollajen 168.3 ul pipetle. </li><li> Daha sonra, aynı mikro santrifüj tüpüne bir pipet kullanılarak, sarı-yeşil floresan karboksilat ile modifiye edilmiş mikro-18 ul ekle. Vortex 30 sn tüm çözümleri ile mikro santrifüj tüpü. </li><li> Mikro santrifüj tüpüne istenilen hücre medya-hücre karışımı (yaklaşık 2 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonu) 77.7 ul ekleyin ve 20 saniye süreyle pipet kullanarak karıştırın. Gerektiğinde, flüoresan boncuklar ve hücre canlılığı tablo (Tablo 1) ilave için uyarlanmış özel kolajen karışım, aşağıdaki matris yoğunluğunu değiştirmek. </li><li> Pipet 300 &amp; #181; de merkezi haline kollajen hücre karışımı l hazırlanan kalıp düzeneğinin (iyi # 2). Tek kullanımlık bir Petri kabı üzerine kalıp yerleştirilir ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 20 dakika boyunca standart bir inkübatör içine hareket eder. </li><li> Inkübatör sistemi çıkarın ve biyo-kaputun içine geri koyun. Forseps kullanarak, her lamel tepesine sıkma ve uzak kalıp yukarı çekerek ve hem hidrofobik kapak fişleri çıkarın. </li><li> Kollajen kalıp taraf düzlemsel difüzyon degrade sağlamak için düz hala emin olmak için istenen mikroskopi ve görüntü için tüm sistemin taşıyın. </li><li> 100 ul tek kanallı pipet kullanarak mikroskop altında hala sistemi ile, iyi 1. içine hücre medya 100 ul ekleyin. Sonra, 100 ul tek kanallı pipet kullanarak iyi 3. içine istenilen kemoatraktan konsantrasyonuna sahip hücre medya 100 ul ekleyin. </li><li> Hemen her iki kuyulara çözümler ekledikten sonra, görüntüleme başlar. </li></ol> 4. Görüntüleme ve DifüzyonModelleme <ol><li> Belirli bir konsantrasyon hesaplamak için belirli kollajen yoğunluğu için difüzyon katsayısı bulmak istiyorsa, aşağıdaki protokolü uygulayın: <ol><li> Yerine istenen kemoatraktan konsantrasyonuna sahip hücre ortamını oluşturma &quot;, Kolajen Karışımı ve 3D Matrix&quot; Yukarıdaki başlıktaki verilen protokol takip standart hesaplamalar ve protokolleri 30 ile 15 ml tüp içinde 5 mcM rodamin olun. </li><li> Görüntü konfokal sistemi ile 3D kollajen matrisleri floresan yakalamak için argon lazer (488 nm) kullanılarak ters mikroskop üzerine monte edilmiş. Resim kadar 7 saat boyunca her 2 ya da 3 sn. </li></ol></li><li> Difüzyon Modelleme için: Aşağıda gösterilen matematiksel model kullanarak, bu genel adımlarla işleme ve analiz için bir hesaplama yazılım kodu yazmak. <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Maksimum niyet etme yoluyla yeniden ölçekleme ve normalleştirme için hesaplamalı yazılımı içine İthalat görüntüversitesi. Kenar seçmek için görüntünün gri renk haritasına görüntüleri dönüştürün. Merkezin sağında ve merkezin solunda, görüntünün ortasında boyunca ekseni seçin. </li><li> Hesaplamalı yazılım kodu kullanarak, gerçek yoğunluk ve ikisi arasındaki fark ile birlikte normalize yoğunluğunu arsa. </li><li> Fitingin (yoğunluk, süre ve uzunluğu) için gerekli Sonra, parametreleri. </li><li> Zamana karşı normalize konsantrasyon ve verilere polinom geçme ile x-ekseni boyunca konsantrasyon profili çizilir. </li><li> Hesaplamalı yazılım kodu kullanarak difüzyon katsayısı hesaplayın. </li></ol></li></ol> 5. Deneysel Ölçümler <ol><li> Lütfen difüzyon denklemi referansla, aşağıda gösterildiği gibi, sistem içinde herhangi bir noktada belirli bir konsantrasyonunu bulmak için denklemi yeniden. <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Nerede: Th L = UzunlukE kolajen matrisi soruşturma kapsamında, x = yeri Difüzyon D = katsayısı t = geçen süre </li><li> Kemotaksis deneyleri sırasında, moment kemokin sisteme eklendiğini belirli bir zaman kaydetmek için emin olun. Hücre göçü hareketi bulunduğunda, konfokal time-lapse kayıt kayıt ve görüntüleme meydana kenarından belirli bir zaman ve konumunu not sağlamak. </li><li> Veri analizi sırasında, difüzyon ve hücre deneyleri hem kolajen içindeki herhangi bir noktada normalize spesifik konsantrasyon bulmak için denklemin içine belirli bir hücre için not geçen zaman, yer ve difüzyon katsayısı takın. </li></ol> TFM kullanılması 6. Takip Cep Göç <ol><li> TFM / DVC teknikleri aşağıdaki protokolü takip kullanarak hücre göçü izlemek için: <ol><li> # 3 içine arzu edilen kemoatraktan konsantrasyonda ilave edildikten sonra, ters çevrilmiş bir MICR üzerine monte edilmiş bir konfokal sistemi ile 3D kolajen matrisleri görüntüleme başlamakOscope hücre araştırmak için bulmak için. </li><li> Hareketli hücre bulunduğunda, görüş alanının ortasında hücreyi yerleştirin ve (z-ekseninde görüntüye) bir piezoelektrik motor, görüntü her 1 veya 2 dk kullanmaktadır. </li><li> Hücre kuvvet oluşturma ve deformasyon hesaplamak için, TFM / DVC protokolleri 31 aşağıdaki floresan boncuk deplasmanları bulmak için bir hesaplama kodu üretmek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Adzick, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Biology+of+Wound+Repair.">The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair.</a> Ann Surg. 225 (2), 236 (1997).</li><li>Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+an+unconventional+approach+to+isolation+of+first+mammalian+morphogens.">Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens.</a> Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).</li><li>Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cancer.">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li><li>Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+effect+of+chemotaxis+on+glioblastoma+tumor+progression.">Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression.</a> AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).</li><li>Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gradient+sensing:+towards+building+predictive+models+of+chemotaxis+in+cancer.">Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Cristini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+Instability+and+Cancer+Invasion.">Morphologic Instability and Cancer Invasion.</a> Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell's+sense+of+direction.">A cell's sense of direction.</a> Science. 284 (5415), 765-770 (1999).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+controlled+molecular+gradients+in+3D+gels.">Generating controlled molecular gradients in 3D gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).</li><li>Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor-induced+cell+motility+in+tumor+invasion.">Growth factor-induced cell motility in tumor invasion.</a> Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).</li><li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+leukocyte+locomotion+and+chemotaxis.">Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).</li><li>Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multichamber+fluidic+device+for+3D+cultures+under+interstitial+flow+with+live+imaging:+development,+characterization,+and+applications.">A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).</li><li>Noo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device.">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).</li><li>Shao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).</li><li>Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+agarose-based+microfluidic+platform+with+a+gradient+buffer+for+3D+chemotaxis+studies.">An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.</a> Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments.">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li><li>Gilbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+diffusion+through+collagen+membranes.">Macromolecular diffusion through collagen membranes.</a> Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).</li><li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+convection+in+collagen+gels:+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium.">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li><li>Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusivity+of+125I-calmodulin+through+collagen+membranes:+effect+of+source+concentration+and+membrane+swelling+ratio.">Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio.</a> Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).</li><li>Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. d. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+modifications+of+collagen+gels:+impact+on+diffusion.">Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion.</a> Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).</li><li>Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-stimulated+chemotaxis+of+human+neutrophils+in+a+3-D+conjoined+fibrin+gel+assay.">Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay.</a> J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li><li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting.">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors.">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).</li><li>Stephenson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , (2010).</li><li>Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fast+Iterative+Digital+Volume+Correlation+Algorithm+for+Large+Deformations.">A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations.</a> Exp. Mech. In press, (2014).</li><li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid,+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes.">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li><li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

veya hücrelerin olmadan başarılı difüzyon deneyleri için en kritik adımlar şunlardır: doğru kalıp düzeneğini kurma; hidrofobik lamelleri çıkarılması sırasında zarar görmesini önlemek için gerekli el becerisi geliştirme; doğru difüzyon katsayısını hesaplamak için çok iyi bir doğrusal başlangıç ​​çizgisine bulmak için sağlanması; kollajen ve kemoatraktan hem deneysel hesaplamalar düzeltmek; Doğru kurumaz matris sağlamak için canlı hücre görüntüleme sisteminin kullanımı;...

kemotaksisi olarak bilinen bir konsantrasyon gradyanı doğru hücrelerinin tercih edilen bir hareketi, vücut patolojik ve fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Bu gibi örnekler, deri ve mukoza yara iyileşmesi, 1 morfogenez 2, iltihap 3 ve tümör büyümesi 4,5 bulunmaktadır. Aynı zamanda kanser hücreleri hem bireysel hem de kolektif hücre göç stratejilerinin 6 doğru göç edebildiğini ortaya konmuştur. Ayrıca, difüzyonel istikrarsızlık mekanizmaları besin kaynağına doğru göç ve dolayısıyla daha geniş alanları ve dokuları 7 istila edebilir sonra bir tümörlü beden / nesneden tek veya kümelenmiş hücrelerin ayrılmasını teşvik edebilirsiniz. Ayrıca, çeşitli göç mekanizmaları nedeniyle adezyon moleküllerinin 8 farklı roller, 2D ve 3D aktif olabileceği gösterilmiştir. Bu nedenle, in vitro tayinlerde fizyolojik ilgili bir hareket, bir measureabl hücre hareketliliğini araştırmak içinE ve basit bir şekilde hücre hareketi fenomeni 9 anlamada önem taşımaktadır. Ne yazık ki, hücre göçü analiz zorluk, kapsamlı ölçülebilir kemotaksi deneyi genellikle tarafsız hücre hareketi ve ulaşım olayları modellerinin ölçümü üzerine kurulmuş uzun zahmetli bir yöntem gerektirir. Hücre kemotaksisini araştırmak için Geçmiş deneysel yaklaşımlar Boyden haznesi 10 ve under agaroz tahlil 11 arasındadır. Bununla birlikte, bu ilk deneylerde, hücre göçü deneyleri zamana göre hareketi izlemek yoktu. Daha da önemlisi, deneyler için kullanılan konsantrasyon gradyanlar iyi tanımlanmış değil veya sadece birkaç saat fazla için sinyalizasyon sürdürülmesi sırasında tam olarak anlaşılamamıştır. Ayrıca, erken kemotaksis odasının girişimleri iki boyutlu hücre göçü kısıtlı ve bir göç 12 kinetiği izlemek için izin vermedi. Boyden odasının baktığımızda, bir uç nokta deneyiAraştırmacı görsel göç gözlemlemek için izin vermez ve doğrudan kemokinezinin (rastgele hareket) den kemotaksis (yönlü hareket) ayırt edemedi. Buna ek olarak, gözenek boyutu ve kalınlığı birkaç değişken-farklar kolayca üretmek için çok zor odasını membranların yapımı ve kemokinlere 13,14 hücrelerin göçmen tepkisini gizli. Mikroakiskan yeni anlayışla, yeni odaları ve mikro cihazlar interstisyel akış koşulları altında hücre lokomosyon araştırmak için bir araç olarak incelenmiştir veya 15,16 kemotaksis oylandı. Bu yeni cihazlar altında, yeni hücre ölçümlerini tanıtıldı ve bir hücre 17,18 üzerinde kayma gerilmesi etkisi gibi, incelendi. Ne yazık ki, geçmiş ve şimdiki mikroakışkan kemotaksis odaları tümör hücre invazyonu ve metastaz, ve im de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçler, çünkü 2B yüzeyler-önemli bir gerileme hücre göçü çalışmalar sınırlıbağışıklık hücre göçü, göç 3D içerir. Doğrudan gözlem odaları-burada bir kemoatraktanttır çözeltisi hücreleri ihtiva eden bir 3 boyutlu jel ile temas halinde olan, aynı zamanda, aynı zamanda 19,20 bildirilmiştir. Bu odalar yatay birbirlerine 21 yanında veya konsantrik halkalar 22 olarak birleştirilmiş, iki bölmeleri, bir kemoatraktan içeren bir ve hücreleri içeren bir tane var. Bu sistemler doğru yöne, ancak uzun bir süre için bir kemotaksis sistemi tutmuyorum. Bundan başka, araştırmacılar da diyaliz hücreleri, hem de hidrostatik basınç 23-25 ​​tabi kolajen örnekler aracılığıyla izleyici moleküllerinin difüzyonuna kolajen zarları aracılığıyla yayılma inceledik. Kollajen jel bazı difüzyon deneyleri manyetik alanlar ve kimyasal birleşme 26 kullanılarak jel fiziksel ve kimyasal değişiklikler dayanır. Colla içinde yayılma modellemek için popüler bir yöntemotojen dokular sürekli nokta photobleaching floresan görüntüleme dayanır. Bu yöntem odaklı kollajenoz dokularda makromoleküllerin difüzyon katsayılarında anizotropiye ortaya koymuştur. Oysa, photobleaching eklem kıkırdağı kullanılır ve matrisleri kollajen edilmiştir. Benzer birlikte, gerekli olan modelleme deneyleri özellikle kollajen jel difüzyon katsayısı anlama yoluyla yapılması gerekir. Daha da önemlisi, sistem, hücre gücü üretimi ölçmek için bir yöntem kullanmaktadır yoktur. Ne yazık ki, çoğu sistem için ideal bir sistem için bir ya da iki temel unsuru eksik gibi görünüyor: Hücre izleme, matris tekrarlanabilirliği bir kolaylığı ile nispeten basit bir set up, en aza indirilmesi yoluyla kemotaktik faktörü ile difüzyon degrade anlayışının izin etkileşimler hücre-hücre ve boyutsal ölçümü için birimler (örneğin, hız, kuvvet, belirli konsantrasyon) ölçmek için yeteneği. Moghe ve diğ. </em&gt; 27 hücreleri başlangıçta jel boyunca dağınık ziyade filtre yüzeyinde konsantre edildiği, bu gereksinimleri en yerine bir sistem önerdi, ancak hücre üretir kuvvetleri ölçmek için zordu. Bu amaçla, biz bir hücreyi ölçmek için görüntü analiz teknikleri ile birleştiğinde time-lapse mikroskopi dayalı mevcut deneyleri, modern yayılma odası sınırlamaları aşmak için izin veren bir 3D kollajen matriks içinde kemotaksis araştırmak için bir düzlemsel degrade difüzyon sistemi sunuyoruz 3 boyutlu bir ortamda kuvvetler. Bu protokol, farklı hücrelerde 3D kemotaksis araştırmak için kullanılabilecek basit bir 3D difüzyon odasını oluşturma basit ama yenilikçi bir yol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>a two-part misture with a 10:1 mix</td></tr><tr><td>Live cell imaging chamber</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB for 18&amp;nbsp;mm round coverslips</td></tr><tr><td>22&amp;nbsp;mm Glass Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. cover slip 22&amp;nbsp;mm 1.5</td></tr><tr><td>Machined aluminum metal cube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hobby utility knife</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Standard floor model and tabletop centrifuges</td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15&amp;nbsp;mm)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Fine Point Forceps</td></tr><tr><td>Cover glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Rectangle; 30 x 22&amp;nbsp;mm; Thickness No. 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Acetic acid ACS reagent, &amp;ge;99.7%</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>anhydrous, 95%</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, for molecular biology</td></tr><tr><td>High-precision diamond scribing tool</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Straight extended tip scribe, .020&quot; (.50&amp;nbsp;mm) diameter by .200&quot; (5.0&amp;nbsp;mm) tip length</td></tr><tr><td>Vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>High-Vacuum Grease</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;N sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Sodium hydroxide concentrate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Rat tail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micro centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Volume: 2.0 ml; &lt;br /&gt;O.D. x L: 13&amp;nbsp;x&amp;nbsp;40&amp;nbsp;mm; &lt;br /&gt;sterile; single-wrapped</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Carboxylate-modified microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;F-8813</td><td>Carboxylate-modified microspheres, 0.5 &amp;micro;m, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamine B for fluorescence</td></tr></tbody></table>

planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

doğru hücre migrasyonunu değerlendirmek için bu testin becerisi sistemin iyi bir kurulum dayanır. Bu nedenle, doğru difüzyon sistemi kalıp tasarım ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, hidrofobik ve hidrofilik hem lamelleri yerleştirerek büyük özen emin yapmak için kritik öneme sahiptir. Sistem düzgün tasarlanmış ve çok bulmak sağlanması difüzyon modelleme aşamasında ise sistemin yayılmasını analiz etmek için, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, bir güze...

Watch this Scientific Journal Video about Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix at JoVE.com

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Görüntüleme.  California State University, Long Beach. Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Video: Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Biyomühendislik

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Nörobilim

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...