Bu protokol, bağırsak bağışıklık hücreleri ve epitel arasındaki etkileşimleri incelemek ve bu etkileşimlerin bağırsak homeostazı ve inflamasyonunda nasıl düzenlenebileceğini incelemek için önemli bir araç sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, epitel ve immün biyolojideki soruları ele almak için kullanılabilecek in vitro modelin azaltılmasıyla kolaylaştırılan mükemmel miktarda deneysel kontroldür. Bu sistem, CD44-pozitif epitel kriptlerinin genişlemesinde ILC1'in rolünü belirlemek için zaten kullanılmıştır ve inflamasyon aracılı gastrointestinal hastalıklar hakkındaki anlayışımızı daha da ilerletme potansiyeline sahiptir.
Başlamak için, çözülmesi için buzun üzerine termal çapraz bağlanan bazal hücre dışı matrisi yerleştirin ve standart bir doku kültürü ile muamele edilmiş 24 delikli plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirerek önceden ısıtın. Daha sonra, organoidler içeren plakayı inkübatörden çıkarın ve ortamı geçilecek kuyudan atın. Daha sonra, kuyucuklara 500 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM F12 ekleyin ve bir P-1000 ucu kullanarak, organoidleri tüm kuyucuklardan 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.
Kuyucukların dibini 250 ila 300 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM F12 ile durulayın, kuyuda hiçbir organoidin kalmamasını sağlayın ve hasat edilen organoidleri içeren 15 mililitrelik tüpe havuzlayın. Bir ila iki günlük hasat edilen organoid peleti bir mililitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM F12'de yeniden askıya alın. Doğuştan gelen lenfoid hücreler başına PBS2 ile 1.5 mililitrelik bir tüpü önceden kaplayın ve daha sonra önceden kaplanmış bir PBS2 ucu kullanarak, tüpe yaklaşık 100 ila 200 organoid dağıtın.
PBS2 kaplamalı bir P-1000 ucu kullanarak, organoidleri içeren PBS2 kaplamalı 1,5 mililitrelik tüpe sıralama adımından hesaplandığı gibi en az 500 ILC1'lik bir hacim ekleyin. ILC1 ve organoidleri 300 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün ve tüpün ucunda bir pelet oluşturmak yerine hücreleri tüpün iç kenarı boyunca çekeceklerinden, küçük çaplı masa üstü santrifüjlerden kaçındığınızdan emin olun. Ardından, süpernatantı peleti rahatsız etmeden yavaşça ve nazikçe çıkarın ve numuneyi buzun üzerine yerleştirin.
Tüpü soğuk bir yüzeyde tutarken, eşit dağılımı sağlamak için organoidleri ve ILC'yi 30 mikrolitre termal çapraz bağlamalı bazal hücre dışı matriste en az 10 ila 15 kez yeniden askıya alın. Tek bir kubbe oluşturmak için termal çapraz bağlanan bazal hücre dışı matristeki ILC organoidlerinin kuyucuk başına 30 mikrolitresini, önceden ısıtılmış 24 veya 48 kuyucuklu bir plakaya uygulayın. Daha sonra, plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 10 ila 20 dakika boyunca doğrudan inkübatöre yerleştirin.
Daha sonra, istenen herhangi bir deneysel sitokin veya bloke edici antikorlarla kuyu başına 550 mikrolitre tam ILC1 ortamı ekleyin ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 24 saat sonra, plakayı inkübatörden yavaşça çıkarın ve lenfositlerin yerleşmesini sağlamak için plakanın bir dakika boyunca bir doku kültürü başlığında oturmasına izin verin. 200 ila 250 mikrolitre malzemeyi çıkarın ve 24 delikli bir plakanın boş bir kuyucuğuna yerleştirin.
Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, lenfositlerin çıkarılmadığından emin olmak için süpernatantı kontrol edin. Süpernatant berraksa, orijinal kuyucuktaki ko-kültüre 300 mikrolitre taze ILC1 ortamı ekleyin. Süpernatantta lenfositler varsa, dört santigrat derecede üç ila beş dakika boyunca 300 ila 400 G'de santrifüj yapın ve peleti 300 mikrolitre taze ILC1 ortamında yeniden askıya alın.
Ardından, hücre süspansiyonunu orijinal kuyucukta kalan 200 ila 250 mikrolitre ortama ekleyin. İmmünofloresan, akış sitometrisi veya FACS kullanarak hedef popülasyonların lizis tamponuna saflaştırılmasını, metinde açıklandığı gibi tek hücreli veya toplu RNA araması veya RT-qPCR ile gen ekspresyon analizi için aşağı akış analizi gerçekleştirin. Geçişin başarıyla tamamlanmasından sonra, sağlıklı ve sağlam organoid kültürler, yeni izole edilmiş kriptlerin iki ila dört gün içinde tomurcuklanan kript yapıları oluşturması gerektiğini ortaya koymuştur.
İnce bağırsak ILC1'i ROR gama-T murin transgenik raporlayıcı hattından izole etmek için akış sitometrik analizi yapıldı ve beklenen ILC sayı aralığı 350 ila 3.500 izole hücre olarak bulundu. Organoidlerle tohumlandıktan sonra, ko-kültürler immünokimya sitokimyası ile görselleştirilebilir. Konfokal mikroskopi, tek başına ve ILC1'lerin varlığında kültürlenen ince bağırsak organoidlerinin görüntülerini ortaya çıkardı.
İmmüno-sitokimyasal boyama, organoid ILC1 ko-kültürlerinde Zonula oklüdens protein-1-pozitif epitel hücrelerine yakın CD45-pozitif ILC1 varlığını ortaya koymaktadır. Akım sitometrisi, epitelyal hücresel adezyon molekülünün organoidlerde intestinal epitel hücrelerini işaretlediğini, CD45'in ise ILC1'leri işaretlediğini göstermiştir. Akım sitometrik grafiği ve immünokimya, ILC1 ile birlikte kültürlendiğinde intestinal epitel hücrelerinde CD44 ekspresyonunun arttığını ortaya koydu.
RT-qPCR çalışmaları, ILC1 ko-kültürünün, TGF-beta 1, 2, 3 nötralize edici antikor tarafından inhibe edilen CD44 varyant 6'yı spesifik olarak yukarı regüle ettiğini ve sadece küçük bağırsak-organoid-kültürlerde rekombinant TGF-beta 1 tarafından yukarı regüle edildiğini göstermektedir. Tüm yapıların korunmasını sağlamak ve santrifüjlemeden sonra yapıların yeterince peletlenip peletlenmediğini kontrol etmek için organoidlerin manipülasyonu sırasında nazik olmak önemlidir. Diğer bağışıklık ve bağışıklık dışı bileşenleri ekleyerek sistem karmaşıklığını artırarak, bu in vitro sistem bağırsak biyolojisindeki diğer soruları ele almak için kullanılabilir.
