Bu teknik, S genotipini etkili bir şekilde tanımlayabilir ve narenciye öz uyumsuzluğunu doğru bir şekilde tanımlayabilir ve uygun polenleştirici ağaçlarının seçilmesi için gerekli bilgileri sağlayabilir. Bu, ıslah programlarında uygun ebeveyn ağaçlarını seçmek için zaman verimli, basit ve güvenilir bir tekniktir. Bu tekniğin yapılması basit ve kolaydır ve ilk kez deney yapmak sabır ve özen gerektirir.
S genotipinin tanımlanması ve S'ye özgü astar tasarımı daha fazla dikkat ve özen gerektirir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olan Yu Hu olacak. Polen toplamaya Majia pomelo, Citrus maxima, çiçekleri laboratuvara götürerek başlayın.
Anterleri cımbız kullanarak toplayın ve filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Anterleri içeren Petri kabını 24 saat boyunca 28 santigrat derecelik bir fırına koyarak polen tanelerini kurutun. Kuruduktan sonra, poleni renk değiştiren silika jel içeren Micro Centron hava geçirmez fermuarlı kilitli bir torbada saklayın.
Torbayı kapatın ve torbayı polen çeşidinin adı ve depolama tarihi ile etiketleyin. İki mililitrelik bir santrifüj tüpünün kapağına 300 mikrolitre sıvı ortam dökün ve poleni bir tozlaşma fırçası yardımıyla eşit şekilde serpin. Polenleri nemlendirilmiş bir kara kutuya yerleştirin ve 12 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, üst bir milimetrelik ucu 1.000 mikrolitrelik pipet ucundan kesin ve poleni az miktarda kültür çözeltisi ile aspire edin. Polenleri mikroskop slaytının ortasına yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün. İşiniz bittiğinde, 10X hedefi kullanarak ters çevrilmiş bir mikroskopla numuneyi gözlemleyin.
Her replika için yaklaşık olarak aynı polen yoğunluğunu kullanarak üç bağımsız replika gerçekleştirin. Tozlaşma için, yeterli miktarda canlı poleni stigmanın yüzeyine yaymak için bir tozlaşma fırçası kullanın ve pistile zarar vermediğinizden emin olun. Tozlaşan çiçekleri bir sülfat kağıt torba ile örtün ve torbayı bir ataş kullanarak kapatarak genotipik olarak farklı polenler tarafından tozlaşmayı önleyin.
Etikete türlerin adını ve tozlaşma sayısını ve zamanını yazın. Etiketi tozlaşmış çiçeklerin yakınındaki dallara asın. Tozlaşmadan yaklaşık üç ila dört gün sonra tozlaşma torbalarını çıkarın ve tozlaşan çiçekleri fermuarlı kilit torbalarında toplayın.
Yaprakları, kapları ve yumurtalıkları çiçeklerden derhal çıkarın ve stilize etmek için kaynaşmış damgalamayı taze hazırlanmış bir fiksatif çözelti içeren bir santrifüj tüpüne batırın. Fiksatif çözeltideki damgalama ve stili gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, stigmayı yıkamadan önce fiksatif çözeltiyi atın ve % 95 etanol içinde iki ila üç kez şekillendirin.
Ardından, stile% 70 etanol çözeltisi ekleyerek numunenin çözeltiye tamamen daldırılmasını sağlayın. Bu aşamadaki stiller bir ila iki ay boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Anilin mavisi boyama için,% 70 etanol içinde saklanan stil örneklerini damıtılmış suyla üç ila dört kez yıkayın.
Dört molar sodyum hidroksit çözeltisine daldırın ve 60 dakika boyunca 65 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe etmeden önce kapatın. Bu adımda, stilin rengi sarı-beyazdan turuncu-kırmızıya değişir. Ardından, stilleri damıtılmış suya batırın.
30 dakika sonra, damıtılmış suyu atın ve stilleri damıtılmış suyla üç ila dört kez veya stilin rengi sarı olana kadar yıkayın. Ardından, numune suya batırılana kadar anilin mavisini ekleyin ve karanlıkta 12 saat boyunca inkübe edin. Polen tüpü büyümesini floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Slaytı düz bir masaya yerleştirin. Bir neşter kullanarak stili uzunlamasına eksen boyunca iki yarıya bölün. Stilin bir yarısını bir cam slayta yerleştirin ve slaytın yüzeyine iki ila üç damla polietilen glikol ekleyin.
Ardından, bir kapak fişi ile örtün. İşiniz bittiğinde, slaytı diyafram açıklığının üzerindeki mikroskop aşamasına yerleştirin ve 10X'lik bir hedef kullanarak görselleştirin. DAPI filtresini kullanın ve polen tüpü büyümesini gözlemleyin.
Her tozlaşma türü için beş stile dikkat edin. Citrus maxima'nın polen canlılığı ve çimlenme oranları floresan mikroskopi kullanılarak ölçüldü. Uyumlu polen, stigmanın yüzeyinde başarılı bir şekilde çimlendi ve normal bir polen tüpü üretti, bu da büyüdü ve sonuçta yumurtalıkta döllenmeye yol açtı.
Buna karşılık, uyumsuz polen tüpleri stilin yaklaşık 2 / 3'ü boyunca büyüdü ve daha sonra büyümeyi durdurdu. Agaroz jel elektroforezi, S lokusuna özgü primerler kullanılarak güçlendirilmiş DNA ürününü tespit etti. DNA ürününün 500 ila 1.000 baz çifti arasında amplifikasyonunu gösterdi.
Karşılık gelen S genotipi tanımlandı. Bu yöntem kullanılarak farklı narenciye türlerinde 21 S haplotipi tanımlanmıştır. Tozlaşma adımı kritiktir.
Sadece başarılı tozlaşma, polen tüplerinin daha sonra gözlemlenmesini sağlayabilir. Teknik, öz-uyumsuzluk özelliklerini analiz etmek ve öz-uyumsuzluğun kadın belirleyicilerini araştırmak ve tanımlamak için kullanılmıştır. Bu yöntem, kendi kendine uyumsuzluk araştırma ve ıslah programları için önemlidir.
Ayrıca, çiftçi topluluğunun meyve bahçeleri için polenleştirici ağaçları seçmesini kolaylaştırabilir.
