Bu çalışmaya katkıda bulunan pek çok ve en Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu Caffrey Membran, geçmişteki ve şimdiki üyeleri hem. Tüm bizim en içten teşekkürlerimizi ve takdir uzanır. Bu çalışma Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Sağlık (GM75915) Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Limerick Üniversitesi hibe kısmen desteklenmiştir.

Yapısal ve işlevsel biyoloji alanında önemli bir odak, biyolojik membran (Şekil 1). Hücre ve alt hücresel organelleri çevreleyen zar, sadece iki lipit molekülleri arasında moleküler ince bir yapıya ve protein ile çivili. Lipid ve proteinlerin yapısı ve fonksiyonu ilgi çekicidir. Ancak, bu makalenin odak zarı proteinleri ile sınırlıdır. Membran proteinlerinin moleküler düzeyde nasıl işlediğini daha iyi bir anlayış, iki nedenden dolayı aranır. Öncelikle, bunların nasıl çalıştığını bilmek, entelektüel tatmin vardır. İkincisi, bir proteinin nasıl çalıştığını bilerek, özel uygulamalar için onu değiştirmeye bile arıza olması gerektiği veya iyileştirilmesi veya düzeltmek mümkün olma ihtimali her zaman vardır. İlaç tasarımı, iş bu tip bariz bir sonucudur. Bir yaklaşım, bir membran proteini moleküler düzeyde nasıl çalıştığını endam yapısını belirlemek için. Bu protein oluşturan bütün atomların 3-boyutlu uzayda yer, ya da en azından olmayan tüm hidrojen atomları, kuran içerir. Bu amaç için kullanılan yöntem makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX). Şekil 2 yapısı tam kullanarak belirlenen bir membran proteini bir örnek gösterir. Protein bir kırınım kaliteli kristal MX yapmak gereklidir. Açıkçası, makromoleküler kristalografisi kullanarak yapı belirlenmesi dahil pek çok adım vardır. Bu Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Tipik olarak, bu bir membran proteini hedef belirleme ve daha sonra, üreten, arındırıcı ve kristalize. Bir ev veya bir sinkrotron X-ray kaynağını kullanarak kristal Kırınım ölçümleri yapılmaktadır. Kırınım verileri sonra moleküler bir modeli ile donatılmış bir elektron yoğunluk haritası verimli işlenir. Bu model, rafine edilmiş, proteinin etki mekanizması keşfetmek için kullanılan ve yapı-bazlı ilaç tasarımı için olabilir Bu makalenin odak noktası, mezo yöntem denilen zarı proteinleri lipidik mesophases kullanarak kırınımı kaliteli kristal üretmeye nasıl göstermektir. Referans 1 (Caffrey 2009) yeni bir değerlendirme yöntemi ve kapsamı kullanılabilir. Referans 2 (Caffrey ve Cherezov, 2009) biz burada takip edecek adım-adım protokolü açıklanmıştır. Bir mezo membran protein kristalizasyon deneme kurmak için gerekli olan ve zaman alan adımları özetleyen bir akış şeması Şekil 4&#39;te gösterilmiştir . Bu makale, kesik kırmızı çizgiler ile kapalı bu adımları kapsar. Bölüm 1: Kristalizasyon Tabaklar hazırlanması <ol><li> Çalışma tezgahı üzerinde Silanlanmış mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Delikli çift sopa ayırıcı bant şerit (piyasada Belirli Reaktifler ve aşağıda Ekipman Tablo) bir yüzey koruyucu kağıt kapağını çıkarın. </li><li> Slayt yüzeyi ile temas halinde, bant, yapışkan tarafı aşağı yerleştirin. </li><li> Basınç mühür brayer veya rulo kullanarak slayt bant. Alüminyum folyo bant ve kuyuların tabanını korumak için silindir arasına yerleştirilir. </li><li> , Üst yapışkan yüzey için bant ikinci kağıt kapağını çıkarın. </li><li> En kısa sürede yükleme gibi hızlı ve etkin bir sızdırmazlık için kuyu plaka yakın yerleştirin bireysel Silanlanmış lamelleri tamamlandı. </li></ol> Bölüm 2: hazırlanması Lipid Şırınga <ol><li> , 45 ° C, 3 dakika boyunca erimiş hale sıcaklık kontrollü bir blok lipid (genellikle monoolein) yerleştirin. </li><li> Lipid erime olsa da, lipid-protein karıştırma adım kullanım için iki adet 100 mcL gaz sızdırmaz Hamilton şırınga hazırlar. Teflon halkalı protein solüsyonu içeren şırınga çıkarın. (Yerine halkalı bırakarak) yanında lipid yapacak şırınga yerleştirin. </li><li> Coupler lipid şırınga (bkz: Belirli Reaktifler ve Ekipman aşağıda ve Referans 3 (Cheng ve ark Tablo, 1998)) bağlayın . Şırıngaya coupler parmağınızla sıkıştırın ama aşırı sıkmayın. Namlu lipid şırınga pistonu çıkarın. </li><li> Lipid devam etmeden önce erimiş olması gerektiğini unutmayın. 30 mcL pipet ve yavaş yavaş erimiş lipid yaklaşık 30 mcL kadar sürebilir. Yavaş yavaş hava boşlukları tanıtmak için özen şırınga gibi açık ucunu erimiş lipid kadar teslim. </li><li> Erimiş lipid ile temas pistonu namlu içine yerleştirin ve yavaş yavaş şırınga ile dikey olarak video gösterilmiştir düzenlenen varil kadar piston önceden. Yanlışlıkla kıstırılmış olabilir hava kabarcıkları süreç içinde yükselişi ve mahkemece serbest bırakıldı. </li><li> Dikkatlice okuyarak şırınga varil üzerinde işaretler şırınga lipid hacmi belirlemek. </li><li> Slayt demirliKuplörün uzanan iğne üzerine Áizelgesine. Varil kadar yavaş ve nazikçe Kuplörün çekirdek iğne içine erimiş lipid zorlamak için piston kullanın. </li></ol> Bölüm 3: Protein Şırınga hazırlanması <ol><li> , 4, 5 ila 10 dakika boyunca 14.000 g protein çözümü eğrilecektir ° C kristalizasyon çalışmalarda kurmadan önce büyük agrega kaldırmak için. Buz protein çözüm çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini sağlayınız. </li><li> Kübik fazda ya da tam hidrasyon yakın kullanmak için protein solüsyonu hacmi hesaplayın. Monoolein 20 ° C, su dolu hidrasyon faz diyagramı 5 (Şekil 5) olarak% 40&#39;ının su (kütle) oluşur. </li><li> 25 veya 50 mcL Hamilton şırınga ile protein çözüm gerekli olan hacim kadar sürebilir. Teflon piston hava kabarcıklarını önlemek için özen protein şırınga namlu ucuna çözüm aktarın. </li><li> Dikkatlice, iğne çekilme ve şırınga protein çözüm hacmini ölçmek. Önceki adımda teslim değeri ile eşleşmesi gerekir. </li><li> Yavaş yavaş, açık ucu ile aynı hizada sonuna kadar varil kadar protein çözüm inç. </li><li> Lipid şırıngaya bağlı kuplör açık ucunu protein şırınga vidalayın. Bu cihaz çok fazla sıkmayın bu kritik önem taşımaktadır. Over-bu aşamada monte karıştırma cihazı sıkma ferülü zarar ve sızıntı neden olacak. Under-sıkma da sızıntı için yol açacaktır. </li></ol> Bölüm 4: Karıştırma Protein Çözüm ve Lipid: Mesophase <ol><li> Karıştırma etkisi coupler üzerinden ve lipid şırıngaya, protein şırınga protein çözüm sürüş başparmak ve işaret parmağı ile, protein tarafında monte karıştırma ünitesi sınırına piston önceden. </li><li> Lipid tarafında piston Kuplörün ve protein şırıngaya geri lipid şırınga içeriğini sürücü kullanılır. </li><li> Işlem birçok kez tekrarlanır; bazen, bir yüz geçişleri ya da daha homojen bir mesophase üretmek için gerekli. Karıştırma, Kuplörün malzeme üzerinden ileri ve geri hareketi zaman zaman düzensiz olması ve başında, ekstra güç karıştırma etkisi ihtiyaç vardır. İlk karıştırma genellikle örnek tekdüze olmayan bir bulanıklık gelişimi eşlik eder. Homojenizasyon ilerledikçe yükselen kübik mesophase görünümünü olduğu gibi, doku, daha düzgün ve viskoz kübik fazda karakteristik hale gelir. </li><li> Eğer koşullar uygun ve kübik aşamasını oluşturan, dispersiyon optik şeffaf şırınga varil görünmelidir. Böylece, şırınga varil üzerinde işaretler namlu mesophase ile okunaklı olmalıdır. </li><li> Karıştırma sırasında numune, kısa bir süre için buz üzerinde şırınga mikseri koyarak soğutma homojenizasyon Çok hafif ve şeffaflık başarı hızlandırabilir. Ancak, örnek overcool için önemlidir. </li><li> Bu örnek sıcaklığı, sürtünme ile ısınma 3 nedeniyle yükselmeye neden olabilir Bakım, karıştırma son derece dinç önlemek için önlem alınmalıdır . </li></ol> Bölüm 5: Dispenser Yükleniyor <ol><li> 10 mcL Hamilton şırınga, iğne ve şırınga çıkarın. Teflon halkalı bir yerde bırakın. </li><li> Küçük bir madeni para yardımı ile dağıtıcı tespit somunu çıkarın. </li><li> Cırcır kolu tamamen çekilmiş, şırınga takın, piston ve iğne olmadan dağıtıcı holding halka yoluyla. </li><li> Istinat somun, conta yan bakan şırınga değiştirin ve şırınga açık ucunu sıkıca vidalayın. Bakım şırınga düzgün tutan halka ve namlu cırcır kolu paralel hizalanmış merkezli sağlamak için alınmalıdır. Her iki göz tarafından değerlendirilecek. Bu iki gereksinimleri kaçağı önlemek için kritik öneme sahiptir. </li><li> Tutucu somun, bir kaç döner vida ile sürükleyici bir halka ile piston Pass ve açık ucunu şırınga pistonu kılavuzu. Cırcır kolu tamamen basınız. Namlu içine pistonu hareket ettirin ve namlu özgürce ve doğru yolculuk olduğunu kontrol edin. Serbestçe hareket piston kolaylaştırmak için klavuz vidayı gevşetmek için yardımcı olabilir. Emin olun. Pistonu, teflon ucu varil sıfır mcL mezuniyet işareti ile hizalar kadar basınız. Klavuz vida gevşetti olsaydı, sıkın ve piston serbestçe hareket ettiğini gözden geçirmenizde yarar. </li><li> Diğer şırınga ve Kuplörün mesophase aktarmak için sıfır mcL mezuniyet işareti monte karıştırma ünitesinde bir tarafta pistonu hareket ettirin. </li><li> Karıştırma ünitesi boş bir şırınga (onun yerine halkalı) çıkarın ve hemen yüklenen şırınga bağlamak bir couplerttached - 10 mcL dağıtım şırınga dişli feshine. Kaplin yapıldığı gerginlik derecesi Daha önce de belirtildiği gibi, kritik öneme sahiptir. </li><li> Böylece 100 mcL şırınga Medyumu dağıtım şırınga Yük Kuplörün ile mesophase aktarır. </li><li> Dağıtım şırınga çelik sona ermesinden kısa, düz uçlu bir iğne Güvenli ve dikkatle yerine sıkın. </li><li> Kelepçe sürükleyici halka somunu sıkarak cırcır kolu piston. Bakım kullanılmaz hale getirmekteydi piston puan ve deforme olarak, fındık üzerinden sıkmak için değil alınmalıdır. Kenetli durumda cırcır kolu sağlanan videoda gösterildiği gibi bir inç daha fazla hareket alanı ile sınırlı olması önemlidir. Bunun ötesinde, piston, toka ve teslimi başarısız olabilir bir eğilim var. </li><li> Böylece, iğne boşluğu hacmi doldurma ve namlu, iğne yükleme piston ilerlemek için cırcır davul birkaç kez basınız. Bu adım mesophase sürekli bir dize iğne ucundan çıkıncaya kadar (on kata kadar) tekrar edilmelidir. </li><li> Kristalizasyon çalışmalarda bazı proteinler olmadan kübik eklendi Yağışlı aşamasında kararsız olduğu gibi, hemen başlamalıdır. </li></ol> Bölüm 6: Kristalizasyon Tabaklar ayarlama <ol><li> Bir yüzey üzerine çok iyi kristalizasyon plakası ve kapak yükleme kolaylığı için çalışma tezgahı üzerinde birkaç santim kaldırdı yerleştirin. Yüzey biraz daha karanlık, en iyi kontrast ve geliştirilmiş görünürlük elde edilir. </li><li> Yağışlı çözümler homojenize ve şişeleri şapkasını çıkarmak. 1 mcL Yağışlı dağıtım pipetlemeyin ayarlayın. </li><li> Bir yandan dikey düzenlenen dağıtım şırınga ile, merkezi ve doğrudan kuyusu sayısı 1 baz üzerinde iğne ucu pozisyon için ücretsiz bir elinizi kullanın. Cam yüzeye mesophase bolus sınırdışı yinelenen dağıtıcı düğmesine basın. Bolus hacmi standart yinelenen dağıtıcı 10 mcL şırınga ile kullanıldığında 200 nL. Iğne ucu uygun teslim edilmesini sağlamak için kuyu tabanı üzerinde birkaç yüz mikrometre daha fazla olmalıdır. </li><li> 4 komşu kuyuların mesophase, yeri, 2-mcL pipetlemeyin ve standart tek kullanımlık uçları kullanarak her mesophase bolus üst Yağışlı çözüm 1 mcL yüklendikten sonra. </li><li> Mümkün olduğunca çabuk, düzenli bir şekilde karşılamak için dolu kuyular üzerinde kare lamel yerleştirin. Su geçirmez bir mühür etkisi, ayırıcı bant maruz kalan yapışkan yüzeyi ile temas edinceye lamel baskı uygulamak için bir spatula kullanın. </li><li> Mesophase ve yağışlı dağıtım süreci plaka tüm kuyuları yüklenir ve mühürlü kadar tekrar edilebilir. </li><li> Izleme amacıyla açıkça plaka etiketleyin. Işığa duyarlı protein genellikle kuluçka odasında koymadan önce alüminyum folyo tabak sarma tarafından işlenir. </li><li> 20, genellikle, sıcaklık kontrollü bir odasında tabak koyun ° C </li><li> Polarize Işık Mikroskobu kullanılarak kristal büyüme hedefi ile 20 kat 10 veya kuyulardan düzenli olarak kontrol edin. Yazarın laboratuarda kullanılan takvimi aşağıdaki gibi: gün 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 ve 60 kurulum sonrası. 0.14 mm kalınlığındaki numune içinde odak derinliği ayarlayarak mesophase bolus dikkatlice inceleyin. Sınav, normal ışık ve çapraz-polarize arasında yapılmalıdır. </li></ol> Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar Kristallerin görünüm membran proteini doğal rengi değişecektir, ışığın polarizasyon denetim (veya bunların yokluğu) ve aydınlatma yöntem ve kalite için kullanılır. Şekil 6, birkaç olası kristal görünümleri gösterir. Şekil 6 (b) ve (d Paneller) &#39;de gösterildiği gibi, normal ışık ile bakıldığında mezo büyüyen Doğal renkli membran proteinlerinin bakabilirsiniz. Renksiz membran protein kristalleri küp faz normal ışık ile bakıldığında büyüyen Şekil 6 (Panel e) &#39;de gösterildiği gibi bakabilirsiniz. Son olarak, polarize ışık ile bakıldığında mezo büyüyen renksiz membran protein kristalleri Şekil 6 (a ve c Paneller) gibi görünebilir. Genel yapısının belirlenmesi sürecinde sonraki adımları hasat ve cryo-cool kristallerinin X-ışını kırınımı ve onlardan kaydetme ve analiz etme. Bu konular ayrı vallahi makaleler ele alınacak. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 ve çift katlı lipid gösteren bir biyolojik membran şematik proteinlerin çeşitli bulunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 yapısıvitamin B 12 taşıma protein, BtuB MX ve bu vallahi makalede resimli mezo yöntemi 6 büyüdü kristalleri kullanılarak çözülmüştür. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 yapı-işlev döngüsü hakkında tam bir protein yapısal bilgiler kullanılarak elde edilmesi ve ilgili adımları birçok göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 akış şeması mezo yöntemi membran protein kristallerinin üretiminde yer alan adımları özetlemektedir. Kesikli kırmızı çizgi ile çevrili bu adımları, bu jove makalede kaplıdır. Referans 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 lipid (monoolein) / su sistemi için basitleştirilmiş bir sıcaklık-bileşim faz diyagramı. Kristalizasyon çalışmalarda 20 ° C lipid,% 40 hidrasyon su ile doyurur. Referans 5 ayrıntılı faz diyagramı kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 lipidik mesophase büyüyen membran proteinlerinin Kristaller. (A), vitamin B 12 taşıma protein, BtuB 6, (b) Pseudomonas ışık hasat, II 7 karmaşık (c) adhesin / invasin OPCA 8, (d) bacteriorhodopsin 9, (e) karbonhidrat taşıyıcı. Görüntüler normal ışık (b, d, e) ve (a, c) arasındaki çapraz polarize kaydetti.

<ol>
	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

Kübik faz hassas ve dinamik bir ortamda bir dizi değişkenin değişmesi ile birlikte önemli ölçüde değiştirebilir. Mezo kristalizasyon çalışmalarda tüm potansiyel tuzaklar açıklayan manuel modda kurulum bir tanımını vermek mümkün değildir. Ancak, pek çok zorlukla pahalı protein çözümlere başvurmadan önce tekniği uygulayarak ve ılımlılık, karıştırma sırasında şırınga uygulanan basınç kullanarak önlenebilir. Doğru yapıldığında, mezo yöntemi proteinlerin geniş bir yelpazede kristalleri verebilmesidir sayısı sürekli artmaktadır. Mezo kristalizasyon çalışmalarda kurulumu Burada verilen açıklama, manuel mod üzerinde odaklanmıştır . Bir süreç olabilir, ve genellikle, kristalizasyon koşullarını geniş çaplı tarama gerektiren durumlarda kristalleşme plakaları otomatik kurulum kolaylaştırmak için değiştirilmiş.

* Tam işleme kendi Dar Delik çoğaltıcı detayları Referans 3 sağlanmaktadır.

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

Lipidik mesophases kullanarak zarı proteinleri kristalize için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem çeşitli lipidik kübik faz olarak veya mezo yöntem anılır olmuştur. Yöntemi prokaryotik ve ökaryotik proteinlerin X-ışını kristal yapıları, monomerik, homo ve hetero-multimer kromofor içeren ve kromofor proteinlerin çözmek için kullanılan edildiğini oldukça çok yönlü ve alfa oldu sarmal ve beta-barrel proteinler. Mezo kristalizasyon kullanarak son başarıları insan mühendisliği beta2-adrenerjik ve adenozin A2A G-protein reseptörler. Protokoller monoolein tabanlı mesophase içine membran proteini yeniden ve manuel modda crystallizations kurmak için sunulmaktadır. Genel süreci, kristal hasat gibi ek adımlar, gelecek video makalelerde ele alınacak. Protein yüklü mesophase hazırlamak ve bir kristalizasyon plaka kurmak için gerekli süre yaklaşık bir saat manuel.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases at JoVE.com

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

crystallizing-membrane-proteins-for-structure-determination-using

Research

JoVE Journal

Biology

29.8K Görüntüleme.  Trinity College Dublin. Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Video: Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Biyoloji

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...