Bu işlemin genel amacı, ribozomları insan hücre hatlarının mitokondrisinden yapısal çalışmalar için yeterli olan büyük ölçekte arındırmaktır. Bu mitokondriyal ribozom arıtma yöntemi, çeviri kompleksleri, mutantlar, kalite kontrol meclisleri ve mitoribosomal alt birim ara larının karakterizasyonuna olanak sağlar. Bunlar mitokondriprotein sentezi ile ilgili anahtar soruları cevaplamak için kullanılabilir.
Bu tekniğin en büyük avantajı, azot kavitasyonunun hücre lisisi için kullanılması ve yüksek çözünürlüklü yapı tayini için mitoribozomların hazırlanması için sadece 10-10 kültür hücresine ihtiyaç duyulmasıdır. Bu teknik mitokondri çeviri makinelerinin yeni bileşenlerinin keşfiile sonuçlanabilir ve kanser tedavisi için yeni tedavi lerin geliştirilmesinde daha fazla kullanılabilir. HEK293S hücrelerini metin protokolüne göre çıkardıktan sonra, iki litrelik hücre tüpünü santrifüj le 1, 000 kez g ve dört santigrat derece yedi dakika hasat edin.
Supernatant'ı dikkatlice decant ve 100 mililitre PBS'de her peleti hızla yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri havuz ve 1, 200 kez g ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat süspansiyon santrifüj. Sonra, dikkatle supernatant dekanting sonra, pelet tartın.
Daha sonra, 120 mililitre MIB tamponu kullanarak yeniden askıya alın ve yeniden askıya alınan hücreleri 20 dakika boyunca soğuk odada şişmeye bırakın. Kamışlı hücreleri buz üzerinde önceden soğutulmuş bir azot kavitasyon odasına aktarın. Daha sonra, hücrelere 45 mililitre SM4 tampon ekleyin.
Azot kavitasyon odasını sabitle ve basınç 500 PSI'ya ulaşana kadar azotla doldurun. Sonra, musluklar kapatın ve 20 dakika buz üzerinde tutun. Azot kavitasyon hücresi lisis yöntemi hücreler üzerindeki dış fiziksel stresi önler, organellerin ısı hasarını önler ve azot gazı hücreleri oksidasyondan korur.
Buna ek olarak, bu son derece tekrarlanabilir bir yöntemdir. Yavaş yavaş oda basıncı bırakın ve lysate toplamak. Daha sonra hücre enkazını ve çekirdeklerini çıkarmak için, lysed malzemeyi 800 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Bir beher içine muslin bez katlanmış bir parça ile dökerek supernatant toplamak buz üzerinde tutulan. Peleti atmayın. MiBSM tampon 90 mililitre pelet resuspend.
Daha sonra homogenizer aşağı bir Teflon cam kullanarak, örnek homojenize ve 10 dakika boyunca 800 kez g ve dört derece santigrat santrifüj tekrarlayın. Yine, bir beher içine muslin bez katlanmış bir parça ile dökerek supernatant toplamak buz üzerinde tutulan. Sonra, ilk supernatant ile bu supernatant birleştirin.
Numuneyi 1,000 kez g ve 4 santigrat derece 15 dakika santrifüj edin. Sonra, daha önce olduğu gibi supernatant toplamak. Pelet attıktan sonra, 10, 000 kez g ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat ham mitokondri içeren supernatant santrifüj.
Sıkı kısmı bozmadan gevşek peletleri dikkatlice yıkayın. Daha sonra, sıkı peleti yeniden askıya almak için 10 mililitre MiBSM tampon kullanın. Genomik DNA'yı çıkarmak için numuneye 200 ünite RNase-Free DNase ekleyin ve numuneyi eşit olarak sindirmek için tüpü soğuk odadaki bir silindirin üzerinde 20 dakika döndürün.
Numuneyi 10, 000 kez g ve 4 santigrat derece 15 dakika santrifüj edin ve peleti askıya almak için iki mililitre SEM tamponu kullanın. Tüm mitokondriyal süspansiyonu sakaroz degradesinin üzerine yükleyin. Metin protokolüne göre degrade döndükten sonra, bir transfer pipeti kullanarak, %32 ve %60 sakaroz arabiriminde göç eden kahverengi bandı dikkatlice toplayın.
Bu protokol hücreleri kırmak için azot kavitasyonu kullanır. Bir kez hakim, son derece saf, bozulmamış mitokondri büyük ölçekli izolasyon dokuz saat içinde yapılabilir ve kolayca değiştirilebilir ve farklı hücre türleri ve ölçekler için adapte edilebilir. Buz üzerinde donmuş mitokondri çözüldükten sonra, mitokondri üç mililitre lysis tampon iki cilt ekleyin.
Hemen tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Lizis ile yardımcı olmak ve reaksiyonu tamamlamak için 5 ila 10 dakika buz üzerinde homogenate kuluçka homogenizer aşağı küçük bir Teflon cam kullanın. Çözünmez malzemeyi çıkarmak için 30, 000 kez g ve 4 santigrat derece 20 dakika lysate santrifüj.
Sonra, dikkatle supernatant toplamak ve pelet atın. Supernatant açıklama sağlamak için santrifüj tekrarlayın. Sonra, dikkatle supernatant toplamak ve pelet atın.
Her bir mililitre lysed malzeme için, tüplere 0,4 mililitre sakaroz yastığı ekleyerek TLA-120.2 ultra berrak bir tüpte sakaroz yastığı hazırlayın. Her sakaroz yastığının üzerine yaklaşık bir mililitre likit mitokondri katlanır ve bu da 2,5'e bir likat-yastık oranı ile sonuçlanır. Daha sonra, 231, 550 kez g ve 4 5 derece santigrat 45 dakika bir TLA-120.2 rotor örnek santrifüj.
Supernatant atın ve tüp durulamak ve artık sakaroz kaldırmak için resuspension tampon 100 mikrolitre kullanın. Peletleri yeniden askıya alın ve toplam 100 mikrolitre resuspension tamponu yla birleştirin. Yastık pelet resuas ederken, bu örnek ısıtma önlemek için buz üzerinde gerçekleştirmek ve aynı zamanda mitokondriyal ribozomların yapısal bütünlüğünü sağlamak için örnek köpük önlemek için gereklidir.
Geri kalan agregaları eritmek ve tüpleri 10 dakika boyunca 17, 949 kez g ve dört santigrat derecede santrifüj etmek için numuneyi 30 saniye boyunca yavaş hızda girdaplayın. Dikkatle supernatant toplamak ve santrifüj tekrarlayın. A260'ta mitoribozom emilimini ölçtükten sonra, numunenin tamamını tek bir lineer sakaroz gradyan tüpe yükleyin.
Numuneyi 213, 626 kez g ve 4 derece santigrat derece 120 dakika TLS-55 rotorda santrifüj edin. Degradeyi kesirlemek için tüpün altını delin ve numuneyi 96 kuyulu bir plaka içinde toplayın. Mitoribozom arınma mitoribozomlar yeterli miktarda için yedi saatten fazla sürmemelidir.
Bu sürekli sakaroz gradientgösterdiği gibi, saflaştırılmış mitokondri% 32-60 arayüzü kahverengi alt bant göç. Mitoribozomların bir sakaroz gradyan üzerinde çözünür mitokondriyal komplekslerden ayrılmasından sonra, iki büyük mitoribosomal popülasyon, monomonim 55S ve büyük alt birim 39S tanımlanır. Büyük alt birim fraksiyonunun varlığı, hücrelerin aktif olarak bölünen bir durumda toplanmış olduğunu gösterir.
Bu panel, piksel başına 1,23 angstrom'un kalibre edilmiş büyütmesiyle monozom tepe ikiden alınan numuneyi içeren bir mikrograf gösterir. Burada gösterilen ilk işlemden sonra bozulmamış monozomlar ortaya veri. Son olarak, bu panelde tek eşli bir 3D rekonstrüksiyon gösterilmiştir.
Bu videoyu izledikten sonra, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için sağlam insan mitoribozomları hazırlamak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Protokolümüz diğer mitokondriyal makromoleküllere ekstrapolasyon yapılabileceği yüksek kaliteli son preparatlar sunmaktadır.
