Bu çalışma, Avrupa Hematoloji Derneği'nden Research Advanced Grant 2021, Amerikan Hematoloji Derneği'nden 2021 Küresel Araştırma Ödülü ve Welcome Trust ve Edinburgh Üniversitesi tarafından finanse edilen Dahili Strateji Destek Fonu ISSF3 tarafından desteklenmiştir. Flow Sitometri Tesisi'nden Fiona Rossi'ye Flow sitometri analizindeki desteği için teşekkür ederiz. Açık erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Tarafından Kabul Edilen Makale sürümüne bir Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.

hiPSC kaynaklı endotel hücrelerinin farklılaşması ve mekanik stimülasyonu

<ol>
	<li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+before+birth:+clues+from+gene+knockouts+and+mutations.">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li><li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development.">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li><li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis.">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li><li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Li&#232;vre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny.">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells.">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li><li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium.">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis.">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li><li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis.">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow.">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li><li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow.">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development.">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339 (2022).</li><li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition.">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103 (2021).</li><li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li><li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture.">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li><li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation.">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157 (2020).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li><li>Yang, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen:+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells.">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219 (2018).</li><li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells.">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li><li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs.">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow.">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li><li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+generation+of+endothelial+differentiation:+Tissue-specific+ECs.">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li><li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2.">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development.">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822 (2020).</li><li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth.">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing.">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li><li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow.">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965 (2017).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada tarif ettiğimiz protokol, insan pluripotent kök hücrelerinden mekanosensitif endotel hücrelerinin üretilmesine ve bunların kontrollü kayma gerilmesinin aracılık ettiği mekanik stimülasyona tepkilerinin incelenmesine izin verir. Bu protokol tamamen sitokin bazlıdır ve hücre tedavisi için hücre üretimine potansiyel çeviri için GMP reaktifleri ile tamamen uyumludur.
HiPSC'lerin türetilmesi, bilim insanlarına embriyonik gelişimin erken aşamaları için, aksi takdirde in vivo24 üzerinde çalışılması zor olan süreçlerin incelenmesini sağlayan araçsal bir model sağlar. Aslında, araştırma için mevcut olan insan embriyonik dokuları, dolaşımı olmayan embriyolardan toplanır ve bu, mekanik ipuçları tarafından kontrol edilen moleküler imza üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Burada açıklanan yaklaşım, kayma gerilimine hücre tepkisinin canlı görüntülenmesini ve gerçek zamanlı olarak incelenmesini sağlar. HiPSC'lerin akışkanlarla kombinasyonu, dolaşımın başlatılması kardiyovasküler ve kan sistemininkurulmasını yeniden şekillendirdiğinde ve kontrol ettiğinde, gelişmekte olan fetal dokuların sınırlı kullanılabilirliğinin ve erişilemezliğinin üstesinden gelen bir çalışma modeli sağlar 3,9,10,25.
Protokolün bir sınırlaması, bu protokolden türetilen endotel hücrelerinin, gelişmekte olan dokularda bulunan farklı endotel hücrelerinin çeşitli kimliklerini yansıtmayabilmesidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, istenen kimliği veya dokuya özgü fenotip26'yı elde etmek için akışkan stimülasyondan önceki farklılaşma işlemi sırasında spesifik bir sitokin kombinasyonuna ihtiyaç duyulabilir. Endotelyal alt kümelerin izolasyonu, izolasyon adımı sırasında daha rafine bir immünofenotip kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, endotel hücrelerini yalnızca CD34 ekspresyonuna dayalı olarak izole eder, böylece floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) yerine kolon izolasyonuna izin verir; Bu, hücre ölümünü ve kontaminasyon riskini azaltır. Ayrıca, bu protokol, laminer akışın aracılık ettiği kesme geriliminin rolünü incelemek için özel olarak tasarlanmıştır. Germe veya sıkıştırma gibi diğer mekanik ipuçlarının veya bozulmuş veya bozulmuş akış gibi diğer akış türlerinin etkisini incelemek için alternatif akışkan yaklaşımların kullanılması gerekecektir.
Daha önce iPSC'den türetilen endotel hücrelerinin, fetal dorsal aortta 28,29,30 gözlemlenene benzer heterojen arteriyovenöz hücresel kimlikleri 27 taklit ettiğini göstermiştik. Bu, kan dolaşımı tarafından kontrol edildiği bilinen damar gelişimi ve hücresel spesifikasyon bağlamında özellikle önemlidir. Farklı modellerde yapılan çalışmalar, dolaşım eksikliğinin arteriyovenöz spesifikasyonun değişmesine neden olduğunu göstermiştir11,14,31. Mekanik ipuçlarını hücre spesifikasyonuna bağlayan mekanizmalar hala bilinmemektedir ve burada açıklanan boru hattı, in vivo olarak test edilemeyen rafine fonksiyonel çalışmalara izin vermektedir.
Bu boru hattı, ticari olarak temin edilebilen akışkan kanallar kullanılarak hiPSC'lerden türetilen endotel hücrelerinin üretimini ve uyarılmasını açıklar ve cihazların yaygın olarak kullanılan polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlarında olduğu gibi döküm ihtiyacını ortadan kaldırır12. Ayrıca, PDMS çiplerinin kullanılması, uyarılan hücrelerin toplanmasını özellikle zorlaştırırken, bu protokol ile hücreler kanaldan kolayca alınabilir. Bu, proteomik ve transkriptomik analizler, akış sitometrisi ve daha fazla kültüre veya in vivo tahlillere ihtiyaç duyabilecek fonksiyonel tahliller gibi sonraki analizlere izin veren analitik gücü önemli ölçüde artırır.

Embriyonik gelişim sırasında kalp, endokardiyal tüp oluşumunun en erken aşamasından itibaren saptanabilir kasılmalarla1 işlevsellik 1 kuran ilk organdır2. Dolaşım, damar içindeki kan akışının aracılık ettiği mekanik ipuçlarıyla birlikte, erken gelişimin birçok önemli yönünü kontrol eder. Fetal dolaşım kurulmadan önce, vaskülatür primer bir kapiller pleksus halinde düzenlenir; Kardiyak fonksiyon üzerine, bu pleksus venöz ve arteriyel vaskülatür3 olarak yeniden düzenlenir. Arteriyovenöz spesifikasyonda mekanik ipuçlarının rolü, kan akışı başlamadan önce arteriyel ve venöz belirteçlerin pan-endotelyal ekspresyonu ile yansıtılmaktadır4.
Hemodinamik kuvvetler sadece damar sisteminin gelişimini kontrol etmekle kalmaz, aynı zamanda kan hücresi oluşumunun kontrolünde de temel bir rol oynar. Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler), embriyoların farklı anatomik bölgelerinde sadece gelişimin erken evresinde bulunan hemojenik endotel 5,6,7,8 adı verilen özel endotel hücrelerinden ortaya çıkar. Kalp yetmezliği olan modeller, in vitro modellerle birlikte, mekanik ipuçlarının hemonojenik endoteldenHSPC üretimini yönlendirdiğini ve artırdığını göstermiştir 9,10,11,12,13,14.
Farklı akış dinamiğinin, hem hemojenik endotel 16,17 hem de arteriyel hücre spesifikasyonu18'de önemli olduğu bilinen hücre döngüsünü 15 farklı şekilde kontrol ettiği gösterilmiştir. Toplamda, mekanik ipuçları, gelişim sırasında hücre kimliğinin ve işlevinin kritik belirleyicileridir. Yeni in vitro akışkan cihazlar, in vivo insan kanı gelişimi sırasında gelişimsel mekanobiyoloji çalışmasıyla ilgili sınırlamaların üstesinden gelmemizi sağlar.
Bu makaledeki protokolün genel amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) in vitro türetilen insan endotel hücreleri üzerindeki kayma geriliminin etkisini incelemek için deneysel boru hattını adım adım tanımlamaktır. Bu protokol, hiPSC'lerin endotel hücrelerine farklılaşması ve daha sonra stimülasyon protokolü için akışkan çiplere tohumlanması hakkında ayrıntılı talimatlar içerir. Bunu kullanarak, farklı in vitro türevli endotel hücreleri, akışa yanıt olarak yönelimlerini analiz ederek kayma stresini algılama yetenekleri açısından test edilebilir. Bu, diğer laboratuvarların kayma stresine verilen yanıt ve bunun farklı endotel hücre kimlikleri üzerindeki fonksiyonel sonuçları hakkındaki soruları ele almasına izin verecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 Luer uncoated slide</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>IB-80186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% BSA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cited as Dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspiration pipette</td>
			<td>Sardtedt</td>
			<td>86.1252.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Cited as Neuronal cell culture supplement (50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS DIVA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Version 8.0.1</td>
			<td>Cited as flow cytometry software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Microbead kit</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>30-046-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 PE clone 4H11</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>44-0349-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar cell-repellent surface 6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657970</td>
			<td>Cited as cell-repellent plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemicals&#160;</td>
			<td>13122-1mg-CAY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10&#160; cell cryopreservation</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2874-100ML</td>
			<td>Cited as Cryopreservation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200-664-3</td>
			<td>Cited as DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPB Ca2+ Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo</td>
			<td></td>
			<td>Version 10.7.1</td>
			<td>Cited as flow cytometry sanalysis oftware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLT3L</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Cited as L-glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham F-12&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin</td>
			<td>Merk</td>
			<td>T0665-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Fujifilm UK LTD</td>
			<td>9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Cited as Pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ioLight/Thisle Scientific</td>
			<td>IOL-IO-INVERT</td>
			<td>Cited as inverted in-incubator microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilised BSA&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td>Cited as Magnetic separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyil Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>Cited as Magnetic column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6145-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notebook for pump system</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 37-41%</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>F/1501/PB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastette</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>612398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>IB-10964</td>
			<td>Cited as Perfusion set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>Cited as Flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td></td>
			<td>Verison 9.4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>version 1.6.1</td>
			<td>Cited as Pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem cell tecchonologies</td>
			<td>5872</td>
			<td>Cited as Detaching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP4</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEPO</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIGF1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11-100uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL11</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-11-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-03-10uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL6</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>206-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhLaminin-521</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A29248</td>
			<td>Cited as Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhSCF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHC2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhTPO</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>288-TPN-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhVEGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Lysis Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial Connector for &#181;-Slides: Sterile, Sterile</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>IB-10830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-CD34 SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10639011</td>
			<td>Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-CD34 Nutrient Supplement&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10641-025</td>
			<td>Cited as 34 nutrient supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1000701</td>
			<td>Cited as Culture media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Cited as iRock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model of fetal human vessel on-chip to study developmental mechanobiology

Kalp, gelişim sırasında işlevsel olarak kurulan ilk organdır, bu nedenle gebeliğin çok erken dönemlerinde kan dolaşımını başlatır. Fetal dolaşım, fetal büyümeyi sağlamak için oksijen ve besinlerin taşınmasının yanı sıra, endotel tabakasında meydana gelen birçok önemli gelişimsel olayı mekanik ipuçları aracılığıyla kontrol eder. Biyomekanik sinyaller kan damarı yapısal değişikliklerini indükler, arteriyovenöz spesifikasyonu oluşturur ve hematopoietik kök hücrelerin gelişimini kontrol eder. Gelişmekte olan dokuların erişilemezliği, dolaşımın erken insan gelişimindeki rolünün anlaşılmasını sınırlar; Bu nedenle, in vitro modeller, damar mekanobiyolojisi çalışması için çok önemli araçlardır. Bu makale, endotel hücrelerini insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden ayırt etmek ve daha sonra mekanik ipuçlarına tepkilerini incelemek için akışkan bir cihaza tohumlanmaları için bir protokolü açıklamaktadır. Bu yaklaşım, mekanik stimülasyon altında endotel hücrelerinin uzun süreli kültürüne ve ardından fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyon için endotel hücrelerinin alınmasına izin verir. Burada oluşturulan in vitro model, insan fetal yaşamı boyunca damar gelişimini düzenleyen mekanik ipuçlarının aracılık ettiği sinyallemeyi ileten hücre içi moleküler mekanizmaları aydınlatmak için etkili olacaktır.

During embryonic development, the heart is the first organ to establish functionality1, with detectable contractions from the earliest stage of endocardial tube formation2. Circulation, along with the mechanical cues mediated by the flow of blood within the vessel, controls many crucial aspects of early development. Prior to fetal circulation establishment, the vasculature is organized into a primary capillary plexus; upon cardiac functioning, this plexus reorganizes into venous and arterial vasculature3. The role of mechanical cues in arteriovenous specification is reflected by the pan-endothelial expression of arterial and venous markers before blood flow initiation4.
Hemodynamic forces not only control the development of the vasculature itself but also play a fundamental role in the control of blood cell formation. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) emerge from specialized endothelial cells called hemogenic endothelium5,6,7,8, present in different anatomical regions of the embryos exclusively in the early stage of development. Heart-deficient models, together with in vitro models, have demonstrated that mechanical cues instruct and increase HSPC production from the hemogenic endothelium9,10,11,12,13,14.
Different types of flow dynamics have been shown to differentially control the cell cycle15, known to be important in both hemogenic endothelium16,17 and arterial cell specification18. Altogether, mechanical cues are critical determinants of cell identity and function during development. Novel in vitro fluidic devices allow us to overcome the limitations involved with studying developmental mechanobiology during human blood development in vivo.
The overall goal of the protocol in this manuscript is to describe, step-by-step, the experimental pipeline to study the effect of shear stress on human endothelial cells derived in vitro from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This protocol contains detailed instructions on the differentiation of hiPSCs into endothelial cells and their subsequent seeding into fluidic chips for the stimulation protocol. Using this, different in vitro-derived endothelial cells can be tested for their ability to sense the shear stress by analyzing their orientation in response to the flow. This will allow other laboratories to address questions about the response to shear stress and its functional consequences on different endothelial cell identities.

Yazar Spot Işığı: Akışkan Aracılı Mekanik Stimülasyon Altında Kültürlenen hiPSC'den Türetilmiş Endotel Hücrelerinin İncelenmesi 

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

Our research explores how mechanical cues instruct the fate of endothelial cells during development, for which we combine human-induced pluripotent stem cell differentiation with fluidic-mediated mechanical stimulation. Endothelial cells are constantly exposed to the movement of blood, so important signals are missed out in static culture, which makes this the main challenge in studying endothelial cell biology using traditional culture systems. Mechanical cues, in fact, activate many crucial signaling pathways that might be overlooked in cells cultured in static conditions.Our protocol provides an easy, step-by-step guide on how to differentiate and mechanically stimulate induced pluripotent stem-cell-derived endothelial cells. This will help many laboratories in adopting a thermic culture to easily address questions about endothelial cell behavior while under flow.

Burada, hiPSC'lerden türetilen endotel hücrelerinin farklılaşması ve mekano-stimülasyonu için mekanik ipuçlarına tepkilerinin incelenmesine izin veren bir protokol açıklıyoruz (Şekil 1). Bu protokol, fonksiyonel olarak mekanosensitif endotel hücrelerinin üretimi ile sonuçlanır. Burada temsili sonuçlar sunuyoruz ve hücrelerin farklılaşma sırasında sitokin stimülasyonuna nasıl tepki verdiğini değerlendirmek için beklenen fenotipi tanımlıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> Şekil 1: Diferansiyasyon ve mekanik stimülasyon protokolünün şeması. Farklı sitokin karışımlarının zamanlamasını, CD34+ hücre izolasyonunu, akışkan çip tohumlamasını ve mekanik olarak uyarılan hücrelerin son analizini gösteren farklılaşma protokolünün şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
hiPSC'lerin kültürü Protokolü, kendini yenileme koşullarında doğru şekilde büyüyen hiPSC'lerden başlatmak önemlidir. Kültürün kalitesinin iyi bir göstergesi, büyümelerinin hızıdır. Çözüldükten sonra, hücrelerin iyi bir farklılaşma sağlayacak doğru büyüme aşamasına ulaşması için 2-3 haftaya ihtiyacı olabilir. Hücreler haftada iki kez 1:6 oranında neredeyse tam birleşmeye ulaşarak geçebildiklerinde, bu, geçişleri gereken gün farklılaşmaya hazır oldukları zamandır.
HiPSC'lerin endotel hücrelerine farklılaşması Embriyoid cisimciklerinin (EB'ler) oluşumundan oluşan farklılaşmanın ilk adımı, hücre hattına bağlıdır ve kullanımdaki spesifik hücre hattı için bir miktar optimizasyona ihtiyaç duyabilir. Protokol adımları 1.3.2.2-1.3.2.4'te açıklanan ayrışma, ayrışma reaktifi ile inkübasyonun azaltılması veya uzatılması ve ardından Pasteur pipeti ile ayrışma yoluyla değiştirilebilir. Ayrıca, bu adım için kolonilerin bir kesici alet veya bir P100 pipet ucu ile fiziksel olarak ayrıştırılmasına ek olarak başka ayrışma reaktifleri de kullanılabilir. İyi kalitedeki EB'ler, farklılaşmanın 2. gününde tanımlanmış bir kenar gösterir ve mikroskop kullanılarak gözlemlendiğinde net ve parlak görünür; daha koyu alanlar EB'ler içinde hücre ölümünü gösterebilir (Şekil 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> Şekil 2: Embriyoid cisimlerin morfolojisi. (A) İyi tanımlanmış dış kenarları ve tutarlı boyutu gösteren 2. gün embriyoid gövdeleri. (B) Yapının ayrışmasına yol açan geniş hücre ölümü gösteren düşük kaliteli 2. gün embriyoid cisimleri. Ölçek çubuğu = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. günde, EB'lere CHIR99021 eklenmesi GSK-3 proteinini inhibe eder ve bu da Wnt yolunun aktivasyonuna neden olur. Farklı hücre hatlarının CHIR tedavisine farklı yanıtları vardır ve bu, farklı konsantrasyonlar kullanılarak 8. günde elde edilen CD34+ hücrelerinin sayısını ölçerek test edilmelidir (Şekil 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> Şekil 3: Farklı CHIR tedavileri ile endotel hücre farklılaşması. Endotel hücre bağlılığı, CD34 membran ekspresyonu ile farklılaşmanın 8. gününde akış sitometrisi ile ölçüldü, 2. günde (A) 3 μM, (B) 5 μM ve (C) 7 μM'de CHIR tedavisini takiben Akış sitometrisi verileri, beş lazerli sitometreler ve özel yazılım kullanılarak elde edildi (bkz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
CD34+ hücre izolasyonu Manyetik boncuklar kullanılarak yapılan CD34+ zenginleştirmenin, kolonun elüsyonundan sonra en az %80 CD34+ sağladığını doğrulamak önemlidir. Yeterli saflığı sağlamak için, manyetik izolasyondan elde edilen hücrelerin bir kısmı, manyetik zenginleştirme için kullanılandan farklı bir antikor klonu kullanıldığından emin olarak akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Burada 4H11 klonu kullanılmış ve zenginleştirme sonrası ~%85 saflık elde edilmiştir (Şekil 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> Şekil 4: Manyetik ayıklama ile zenginleştirmeden önce ve sonra CD34'ün membran ekspresyonu. 8. gün ayrışmış embriyoid cisimler (gri) ve manyetik zenginleştirme sonrası hücreler (yeşil) CD34 ekspresyonu için boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi ve sıralama sonrası başarılı zenginleştirme gösterildi. Akış sitometrisi verileri, beş lazerli sitometre ve özel yazılım kullanılarak elde edildi (bkz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hücrelerin akışkan kanala tohumlanması Hücreleri akışkan kanala tohumlarken, endotel hücrelerinin yapışmasını ve çoğalmasını izlemek çok önemlidir. Tohumlamadan sonra, hücrelerin kanala tam olarak yapışması ~ 5 saat sürer (Şekil 5A). Bu aşamada yapışmayı iyileştirmek için alternatif bir kaplama çözeltisi de test edilebilir. Test edilen hücrelerin mekanosensitif olduğunu ve dolayısıyla mekanik stimülasyona cevap verebildiğini doğrulamak için hücre oryantasyonu zaman içinde test edilebilir. Stimülasyondan önceki hücreler rastgele yönelim gösterir (Şekil 5A ve Şekil 5C) ve akış yönüne paralel olarak yeniden yönlendirilirler (Şekil 5B,C). Burada açıklanan protokol, uyarılan hücrelerin endotel kimliğini sağlayan, membran immünofenotiplerinin incelenmesi için akış sitometrisi gibi aşağı akış analizi yapmak için hücrelerin kanaldan toplanmasına izin verir (Şekil 5D, E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> Şekil 5: HiPSC'lerden türetilen endotel hücrelerinin mekanosensitivitesi . (A) Tohumlamadan 48 saat sonra izole edilmiş CD34+ hücrelerinin birleşik tabakası. (B) Dinamik kültür altında 3 gün endotel hücrelerinin yeniden yönlendirilmiş tabakası. (C) 5 günlük dinamik kültürden sonra endotel hücrelerinin oryantasyon analizi. (D) 5 gün boyunca akış altında kültürlenen hücrelerin CD34 ekspresyon profili. (E) Akışkan kanaldan alınan hücre popülasyonunun CD34+ hücrelerinin yüzdesi. Görüntüler, ters çevrilmiş bir inkübatör mikroskobu kullanılarak alındı; akış sitometrisi verileri, beş lazerli sitometreler ve özel yazılım kullanılarak elde edildi (bkz. Ölçek çubukları = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Birim eklendi</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Jambon F-12 Besin karışımı (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>N-2 takviyesi (100x)</td>
			<td>100 adet</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 adet</td>
		</tr><tr><td>B-27 takviyesi (50x)</td>
			<td>50 adet</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>1 adet</td>
		</tr><tr><td>Askorbik asit</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>1.25 mL</td>
			<td>25 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>α-Monotiyogliserol (MTG)</td>
			<td>11,5 milyon</td>
			<td>19,5 μL</td>
			<td>448,5 μM</td>
		</tr><tr><td>İnsan Serumu Albümini</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>2,5 mL</td>
			<td>0.5 mg / mL</td>
		</tr><tr><td>Holo-Transferrin</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>150 μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: 500 mL Serumsuz Farklılaşma (SFD) ortamı için bileşim ve tarif.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Farklılaşma günleri</td>
			<td>Sitokin Karışımı</td>
			<td>Sitokin</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Gün 0 - 2</td>
			<td>Karışım 1</td>
			<td>BMP4</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>2. Gün</td>
			<td>Karışım 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr><tr><td>3. günden itibaren</td>
			<td rowspan="2">3 ve 4'ü karıştırın</td>
			<td>VEGF (Türkçe)</td>
			<td>15 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF (Kadın Sünneti)</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>6. günden itibaren</td>
			<td rowspan="8">Karışım 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>EPO (Yurt Sonu T</td>
			<td>3 U/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Endotel hücre farklılaşması için kullanılan sitokinlerin karışımları, SFD ortamına eklendikleri günler ve son konsantrasyon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kayma Gerilimi (dyn/cm2)</td>
			<td>Zaman (h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Deneyin sonuna kadar</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Dinamik kültür ve uygulama uzunluğu için kesme gerilimi değerleri.
Ek Şekil S1: Bu protokol için kullanılan çip ve boruların geometrisi ve boyutları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S2: Hava pompasını kontrol eden yazılım için adım adım kılavuz ve her adımın açıklaması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S3: Hücre şeklinin, eliptik uyumun ve son ölçümün çizimini gösteren FIJI kullanılarak oryantasyon analizi kılavuzu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo S1: Farklılaşma protokolünde kullanılan sitokinler için birim boyutu, resüspansiyon hacmi ve stok konsantrasyonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying hiPSC-Derived Endothelial Cells Cultured Under Fluidic-Mediated Mechanical Stimulation at JoVE.com

Burada açıklanan, endotel hücrelerini insan pluripotent kök hücrelerinden ayırt etmek için basit bir iş akışı ve ardından mekanik stimülasyonları için ayrıntılı bir protokoldür. Bu, endotel hücrelerinin gelişimsel mekanobiyolojisinin incelenmesine izin verir. Bu yaklaşım, mekanik stimülasyondan sonra kültür çipinden toplanan canlı hücrelerin aşağı akış testleriyle uyumludur.

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Araştırmamız, insan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşmasını akışkan aracılı mekanik stimülasyonla birleştirdiğimiz gelişim sırasında mekanik ipuçlarının endotel hücrelerinin kaderini nasıl yönlendirdiğini araştırıyor. Endotel hücreleri sürekli olarak kanın hareketine maruz kalır, bu nedenle statik kültürde önemli sinyaller kaçırılır, bu da bunu geleneksel kültür sistemlerini kullanarak endotel hücre biyolojisini incelemede ana zorluk haline getirir. Mekanik ipuçları, aslında, statik koşullarda kültürlenen hücrelerde gözden kaçabilecek birçok önemli sinyal yolunu aktive eder.Protokolümüz, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinin nasıl ayırt edileceği ve mekanik olarak nasıl uyarılacağı konusunda kolay, adım adım bir kılavuz sağlar. Bu, birçok laboratuvarın akış altındayken endotel hücresi davranışı hakkındaki soruları kolayca ele almak için termik bir kültürü benimsemesine yardımcı olacaktır.

in-vitro-model-fetal-human-vessel-on-chip-to-study-developmental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

749 Görüntüleme.  University of Edinburgh. Araştırmamız, insan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşmasını akışkan aracılı mekanik stimülasyonla birleştirdiğimiz gelişim sırasında mekanik ipuçlarının endotel hücrelerinin kaderini nasıl yönlendirdiğini araştırıyor. Endotel hücreleri sürekli olarak kanın hareketine maruz kalır, bu nedenle statik kültürde önemli sinyaller kaçırılır, bu da bunu geleneksel kültür sistemlerini kullanarak endotel hücre biyolojisini incelemede ana zorluk haline g...

Video: Yazar Spot Işığı: Akışkan Aracılı Mekanik Stimülasyon Altında Kültürlenen hiPSC'den Türetilmiş Endotel Hücrelerinin İncelenmesi 

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

Gelişim Biyolojisi

﻿Differentiation of hiPSCs into Endothelial Cells

Differentiation of hiPSCs into Endothelial Cells  

To begin, on day zero, pre-warm serum-free differentiation medium or SFD medium containing Mix 1 cytokine to 37 degrees Celsius. Then, under a sterile tissue culture hood, add the Mix 1 cytokine-supplemented medium to each well of a cell repellent six-well plate. To prepare the cells, aspirate the culture medium from a six-well plate containing human-induced pluripotent STEM cells or human IPS cells.Wash them with DPBS followed by aspirating the DPBS. Then, add the dissociation reagent to the cells and incubate them at room temperature for a minute. After aspirating this dissociation reagent, incubate the cells for another three minutes at room temperature.Then, tap the plate containing the cells 10 times on each side to detach the cell clusters. Add one milliliter of pre-warmed Mix 1 cytokine-supplemented SFD medium to the cells per well. Using a pasture pipette, transfer the cell clusters from each well to one well of the cell repellent plate containing the medium with Mix 1 cytokine.After introducing the plate into the incubator, move it back and forth, as well as side to side, to disperse the content evenly and incubate it for embryoid bodies, or EB, formation. The next day, swirl the cell repellent plate containing the EBs to collect them into the center of the wells. Using a pasteur pipette, transfer the EB suspension from the wells to a 15-milliliter centrifuge tube.Wait five to 10 minutes for the EBs to settle at the bottom of the tube. Meanwhile, wash the cell repellent plates with sterile water or DPBS to remove single cells or debris. Add two milliliters of Mix 1 cytokine-supplemented SFD medium to each well of the plate.Now, gently aspirate the supernatant from the centrifuge tube without dislodging the EBs. Resuspend the EBs in the calculated volume of SFD medium containing Mix 1 cytokine. Add one milliliter of EB suspension to each well of the washed cell repellent plate already containing two milliliters of medium.Incubate the plate after dispersing the EBs by gently moving the plate as mentioned before. After gathering the EBs at the center of the wells, add the chiron on the side of each well, avoiding direct contact with the cells, Incubate the wells as demonstrated previously. On days three and six of differentiation, collect the EBs and perform media changes as demonstrated previously for day one.Use SFD medium supplemented with Mix 3 cytokines on day three and use SFD medium supplemented with Mix 4 cytokines on day six. After collecting and settling the EBs from the cell repellent plate into a 15-milliliter centrifuge tube, as demonstrated previously, aspirate the supernatant, then add one milliliter of cell dissociation reagent per well of EB collected in the tube to resuspend the EBs. Next, transfer one milliliter of this EB suspension to each well of the cell repellent plate washed with water.After incubating the plate for 10 minutes in the incubator, use a P1000 pipette to dissociate the EBs in each well by gently pipetting up and down no more than 10 times. Then, add five milliliters of washing buffer per well of dissociated EBs. Collect the cells into a 50-milliliter centrifuge tube by passing them through a 40-micron strainer.After counting the cells in the filtered suspension, spin the cells down for 10 minutes at 300g. Resuspend the cells in 300 microliters of washing buffer by gently pipetting a few times, ensuring no clumps are present. Proceed to isolate the CD34-positive cells using a CD34 microbead kit per the manufacturer's instructions.EBs of good quality showed a defined edge by day two of the differentiation and appeared clear and bright when observed under a microscope. The presence of darker areas indicated cell death within the EBs. Following chiron treatment with varying concentrations on day two, quantifying the number of CD34-positive cells at day eight of differentiation revealed the response of the cell line to the treatment.Flow cytometry showed that the CD34-positive enrichment using the magnetic beads provided about 85%CD34-positive cells.

hiPSC'lerin Endotel Hücrelerine Farklılaşması

Seeding CD34+ Cells into Fluidic Chips

Seeding CD34+ Cells into Fluidic Chips  

To begin, centrifuge the isolated CD34-positive cells and resuspend the cell pellet in 300 microliters of pre-warmed SFM-34 medium that is supplemented with mixed 4 cytokines, and count the cells using 10 microliters of the cell suspension. After counting and resuspending the cells in a final volume of 150 microliters cytokine-supplemented SFM-34, add 0.5 microliters of ROCK inhibitor to it. Slowly aspirate the laminin from fluidic chips by placing the tip of a P200 pipette inside the reservoir on the edge of the channel.Then add the cell suspension into the channel consistently, ensuring no bubbles are formed. Incubate the chip overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide to attach the cells to the channel completely. When the endothelial cells are fully attached, aspirate the medium as described previously.Add 200 microliters of cytokine-supplemented SFM-34 into the chip. Replace the medium daily until the cells reach 90 to 100%confluency.

CD34+ Hücrelerini Akışkan Çiplere Tohumlama

Application of Continuous Flow to Endothelial Cells: Aorta-on-a-Chip

Install the perfusion set into the unit per the manufacturer's protocol. Inside a hood, attach an empty fluidic chip to it and add cytokine supplemented SFM-34 medium to fill both reservoirs under sterile conditions. Transfer the fluidic unit to the incubator, connecting it to the pump for bubble removal and calibration.Carefully remove the fluidic unit with the connected set from the incubator and transfer it into the hood along with the chips containing the cells. Clamp the tubing on both sides of the test chip. Remove the clamped tubing from the test chip and connect the chip containing the cells to the tubing.After removing or opening the clamps, transfer the system to the incubator and connect the air pump to the fluidic unit. Remove the fluidic unit from the pump and move it into the hood. Clamp the tubing on both sides of the chip and remove the tubing from the reservoirs on the chip.After gently removing the medium from the chip, Wash the cells with Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline or DPBS. Add 150 microliters of dissociation buffer and incubate for three minutes at 37 degrees Celsius. When the cells are detached, collect the dissociation buffer from one reservoir and wash the channel once with DPBS.Wash the reservoir with the washing buffer to collect the remaining cells from the chip. Finally, add one milliliter of washing buffer to the collected cells before using 10 microliters from it to count the cells. Before the stimulation, cells showed random orientation, but with stimulation, they reoriented parallel to the direction of the flow.CD34 expression profile of cells cultured under flow for five days and percentage of CD34 positive cells retrieved from the fluidic channel, showed the effectiveness of the protocol.