Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82060341,81560304) ve Hainan Eyaleti Akademisyen İnovasyon Platformu Bilimsel Araştırma Projesi (YSPTZX202134) tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışma Hainan Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan doku örnekleri, insan denekleri içeren çalışmalar olarak kabul edilmemektedir. Bu örnekler adli patolojik tanı amacıyla elde edildi ve geri kalanı bu deneyde diatom DNA'nın ekstraksiyonu için kullanıldı. Araştırmacılar, ilgili paydaşlardan bilgilendirilmiş onam almak için bireyleri kolayca tanımlayamazlar.
NOT: Bu deneyde bildirilen araştırma yönteminin genel uygulanabilirliğini sağlamak için, bu deney temel olarak kullanılan kitin kullanım talimatlarını takip etti ve sadece bazı adımlar değiştirildi. Bu deneyde kullanılan su örnekleri, laboratuvarın yakınındaki havuzlardan rastgele alınmıştır (Ek Şekil 1A). Bu deneyde, boğulan vücudun akciğer dokusu, ekstraksiyon protokolünü göstermek için araştırma dokusu olarak doğrulandı (Ek Şekil 1B). Adli uygulamada, bazen boğulan cesetlerin diğer organ ve dokularını (karaciğer, dalak, böbrek, kemik iliği vb.) diatom DNA'sını çıkarmak için kullanmak da gereklidir, bu da deneyin ilgili bölümünde açıklanacak olan bu deneysel yöntemde küçük karşılık gelen iyileştirmeler gerektirir. Bu deneyde kullanılan akciğer dokusu örnekleri, adli vakalarda açıkça boğulmuş cesetlerden geldi. Akciğer dokusunun diatom içerdiğini kanıtlamak için morfolojik testler yapılmıştır (Ek Şekil 2).
1. Numunelerin ön işlemi
<ol><li>Su numunelerinin ön arıtımı<ol><li>Santrifüj tüpüne 10 mL su numunesi alın ve 5 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin. 9.8 mL süpernatantı bir pipet tabancasıyla dikkatlice atın ve altta kalan yaklaşık 200 μL zenginleştirilmiş diatom su örneğini 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. NOT: Önce ön deney yapılabilir ve 10 mL'lik bir su numunesi zenginleştirme için yeterli değilse başlangıç miktarı artırılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku örneklerinin ön işlemi<ol><li>Boğulan vücuttan 0.5 g akciğer kenar dokusu alın, akciğer dokusunu çamurlu hale gelene kadar tamamen doğrayın veya öğütün. Eksojen diatomların kontaminasyonunu önlemek bu adımın özüdür. Dokuyu makas kullanarak tekrar tekrar parçalara ayırın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DNA ekstraksiyonu
NOT: Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında tamamlanır. 14.500 x g merkezkaç kuvvetine sahip bir masaüstü santrifüj kullanarak; deney başlamadan önce 70 °C'ye ısıtılmış bir su banyosu (veya metal banyosu) hazırlanmalıdır. Tüm adımlar kesinlikle aseptik çalışma ilkelerine uymalıdır.
<ol><li>Su numunelerinin ve dokuların montajı NOT: Su örneği ve doku diatom DNA ekstraksiyon yöntemi aynıdır.<ol><li>Ön işlem görmüş su örneğini içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne cam boncuklar ekleyin. İyice karıştırmak için 10x-15x ters çevirin. Eklenen cam boncuklar, 1:1 kütle oranında karıştırılmış irili ufaklı cam boncuklardan oluşur. Büyük cam küreciklerin çapı 1.5-2.0 mm, küçük cam boncukların çapı ise 0.4-0.6 mm'dir.</li>
		<li>0.5 g ince kıyılmış doku alın, yukarıda tarif edildiği gibi dokuyu içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne cam boncuklar ekleyin. Karıştırmak için 10x-15x ters çevirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüplere 40 μL proteinaz K (20 mg/mL) ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında bekletin, bu süre zarfında ters çevirin ve her 3 dakikada bir 10 kez karıştırın. NOT: Doku tamamen sindirilmemişse, proteinaz K miktarı, çözelti berraklaşana kadar uygun şekilde arttırılabilir.</li>
	<li>Santrifüj tüplerine 200 μL bağlayıcı tampon ekleyin, hemen girdap yapın ve 4 dakika karıştırın (salınım karıştırma frekansı: 3000 rpm). NOT: Bu adımda, yeterli karıştırma yoğunluğu ve süresini sağlamak için çalkalama yoğunluğu ve süresi sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir.</li>
	<li>Santrifüj tüplerini 10 dakika boyunca 70 ° C'lik bir su banyosuna koyun ve çözelti berraklaşır.</li>
	<li>Santrifüj tüplerine 100 μL izopropanol ekleyin, girdap yapın ve 15 saniye karıştırın, bu sırada topaklı çökelme görünebilir. NOT: Yukarıdaki işlem adımlarında uygun güçle iyice karıştırmak çok önemlidir, ancak DNA kesilmesini önlemek için kuvvetli çalkalamadan kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Önceki adımda elde edilen çözeltiyi topaklaştırıcı çökelti ile birlikte adsorpsiyon kolonuna koyun (adsorpsiyon kolonu toplama tüpüne yerleştirilir). Adsorpsiyon kolonu uzunluğu 3.0 cm, çap 1.0 cm ve adsorpsiyon matrisi silikon matris membranıdır.</li>
	<li>30 saniye boyunca 8.000 x g'da santrifüjleyin, atık sıvıyı toplama tüpüne atın ve adsorpsiyon kolonunu tekrar toplama tüpüne koyun.</li>
	<li>Adsorpsiyon kolonuna 500 μL inhibitör çıkarma tamponu ekleyin. 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve atık sıvıyı toplama tüpüne atın.</li>
	<li>Adsorpsiyon kolonuna 700 μL yıkama tamponu ekleyin. 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve atık sıvıyı toplama tüpüne atın. NOT: İlk kullanımdan önce yıkama tamponu şişesine belirtilen miktarda mutlak etanol ekleyin.</li>
	<li>Adsorpsiyon kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin. 13.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve atık sıvıyı toplama tüpüne atın.</li>
	<li>Adsorpsiyon kolonunu boş toplama tüpüne geri koyun. 2 dakika boyunca 14.500 x g'da santrifüjleyin ve yıkama tamponundaki artık etanolün aşağı akış reaksiyonlarını engellemesini önlemek için yıkama tamponunu mümkün olduğunca çıkarın.</li>
	<li>Adsorpsiyon kolonunu çıkarın ve temiz bir santrifüj tüpüne koyun. Adsorpsiyon membranının orta kısmına 100 μL elüsyon tamponu ekleyin.</li>
	<li>Adsorpsiyon kolonunu 3-5 dakika oda sıcaklığında tutun ve 1 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Önceki adımda elde edilen çözeltiyi tekrar santrifüj adsorpsiyon kolonuna ekleyin. Santrifüjlü adsorpsiyon kolonunu 2 dakika oda sıcaklığında yerleştirin ve 1 dakika boyunca 13.400 x g'de santrifüjleyin. NOT: Elüsyon tamponu 70 °C'lik bir su banyosunda yaklaşık 10 dakika önceden ısıtılmalıdır. Elüsyon hacmi 50 μL'den az olmamalıdır; aksi takdirde DNA verimi azalacaktır.</li>
	<li>Ekstrakte edilen diatom DNA'yı ileride kullanmak üzere 2-8 °C'de saklayın. DNA çözeltisi uzun süre saklanacaksa, -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. PCR testi
NOT: Adli örneklerdeki diatomların içeriği genellikle düşük olduğundan, boğulan cesetlerin doku örneği ekstraktları, kendi DNA'ları ile değişen derecelerde doku ve organlar (bu deneydeki akciğerler gibi) içerebilir. Bu nedenle, DNA ekstraktlarında toplam DNA'nın doğrudan tespiti, diatom DNA ekstraksiyonunun durumunu yansıtmaz. Bu deneyde, diatoma özgü primerler seçildi ve ekstrakttaki diatom DNA ekstraksiyonunu değerlendirmek için PCR ürünleri kullanıldı. Ürünler, agaroz jel elektroforezi ile gözlemlenebilir ve analiz edilebilir ve ayrıca daha yüksek hassasiyete sahip gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR erime eğrisi ile analiz edilebilir.
<ol><li>Şablon olarak su örneklerinden ve dokulardan ekstrakte edilen DNA'nın 2 μL'sini ekleyin. İnceleme için aşağıdaki iki yöntemden birini seçin.</li>
	<li>Konvansiyonel PCR testi<ol><li>Diatom22S rDNA fragmanlarını spesifik olarak çoğaltabilen primerler 18 kullanın. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.</li>
		<li>Primerlerin özelliklerine göre PCR reaksiyon sistemini ve amplifikasyon koşullarını oluşturun. Ayrıntılar için Tablo 2'ye bakın.</li>
		<li>PCR amplifikasyon ürünlerini% 2 agaroz jel üzerinde çalıştırın. Görüntülemeyi bir jel görüntüleyici ile gözlemleyin ve analiz edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan kantitatif PCR testi<ol><li>Gerçek zamanlı bir floresan kantitatif PCR reaksiyon sistemi hazırlamak için diatom 18S rDNA fragmanlarını spesifik olarak çoğaltabilen yukarıdaki primerleri kullanın. Ayrıntılar için Tablo 3'e bakın.</li>
		<li>PCR amplifikasyonu gerçekleştirin ve elde edilen amplifikasyon eğrisini ve Ct değerlerini analiz edin. Aynı zamanda, bir program ayarlayın, amplifiye edilmiş ürünlerin çift iplikçiklerini floresan kantitatif PCR-eritme eğrisi teknolojisi ile kademeli olarak tek iplikçikler halinde eritin ve ardından elde edilen erime eğrilerini analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Modifiye edilmiş bir kit kullanarak ekonomik diatom DNA ekstraksiyonu

<ol>
	<li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water.">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li><li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5:+An+immunohistochemical+study.">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).</li><li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inordinate+fondness?+The+number,+distributions,+and+origins+of+diatom+species.">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li><li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology:+a+review.">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241 (2017).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test.">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059 (2022).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier.">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li><li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model:+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning.">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment.">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li><li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+identification+of+algae+(morphological+and+molecular):+species+concepts,+methodologies,+and+their+implications+for+ecological+bioassessment.">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li><li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death:+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes.">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li><li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims:+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing.">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li><li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection.">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis.">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li><li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR.">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008 (2021).</li><li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+shell+incorporated+PHBV/PCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li><li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world's+ocean.">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li><li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+studies+of+silica+biomineralization:+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms.">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li><li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms.">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning:+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy.">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li><li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test.">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom.">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li><li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+diatoms:+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene,+including+new+primers+and+protocols.">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li><li>Vinayak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+gene+markers+detect+diatom+DNA+in+a+drowned+mice+establishing+drowning+as+a+cause+of+death.">Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death.</a> Electrophoresis. , (2020).</li><li>Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms.">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Ben Amor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+TaqMan+qPCR+assay+for+rapid+detection+and+quantification+of+Gymnodinium+catenatum+for+application+to+harmful+algal+bloom+monitoring+in+coastal+areas+of+Tunisia.">Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).</li><li>Doddaraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+early+diagnosis+of+bacterial+blight+in+pomegranate+caused+by+Xanthomonas+axonopodis+pv.+punicae+using+sensitive+PCR+techniques.">Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques.</a> Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).</li><li>Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-positive+diatom+test:+a+real+challenge?+A+post-mortem+study+using+standardized+protocols.">False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols.</a> Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).</li><li>Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+availability+in+benthic+diatom+communities:+photosynthesis+and+migration.">Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).</li><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enzyme+digestion+time+on+the+detection+of+diatom+species.">The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species.</a> Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+DNA+barcodes+for+forensic+discrimination+of+drowning+incidents.">Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents.</a> FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).</li><li>Mizushima, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+heart-specific+RING+finger+protein+207+is+involved+in+energy+metabolism+in+cardiomyocytes.">The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+reference+libraries+for+environmental+barcoding:+a+best+practice+example+from+diatom+research.">Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research.</a> PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Diatom hücreleri, sert silisli hücre duvarları17 tarafından korunur ve diatom DNA'sını çıkarmak için bu yapının yok edilmesi gerekir. Sıradan kitler, diatomların silisli kabuğunu kolayca tahrip etmez; bu nedenle diatom DNA21'i başarılı bir şekilde çıkarmak zordur. Laboratuvarımız, diatom ekstraksiyonu işleminde farklı çaplarda ve farklı kütle oranlarında cam boncuklar ekleyerek en sık kullanılan kan DNA ekstraksiyon kitini geliştirdi. Vorteks ...

Adli tıp uygulamasında, suda bulunan bir cesedin boğularak mı yoksa öldükten sonra mı suya atıldığının belirlenmesi, davanın doğru çözümlenmesi için esastır1. Aynı zamanda adli tıp uygulamasında acilen çözülmesi gereken zor konulardan biridir2. Diatomlar doğal ortamda (özellikle suda) bol miktarda bulunur3,4. Boğulma sürecinde, hipoksi ve stres tepkisi nedeniyle, insanlar yoğun solunum hareketlerine sahip olacak ve çok miktarda boğulma sıvısını soluyacaklardır. Bu nedenle sudaki diatomlar boğulma sıvısı ile akciğere girer ve bazı diatomlar alveolar-kılcal damar bariyeri yoluyla kan dolaşımına girebilir ve kan akımı ile iç organlara yayılabilir 5,6. Akciğer, karaciğer ve kemik iliği gibi iç doku ve organlarda diatomların saptanması, ölümden önce boğulmanın güçlü bir kanıtıdır 7,8. Şu anda, adli diatom testi esas olarak morfolojik test yöntemlerine dayanmaktadır. Dokunun bir dizi ön sindiriminden sonra, sindirilmemiş diatomların morfolojik kalitatif ve kantitatif tahminleri mikroskop altında gerçekleştirilir. Bu süre zarfında, nitrik asit gibi tehlikeli ve çevre dostu olmayan reaktiflerin kullanılması gerekir. Bu süreç zaman alıcıdır ve araştırmacıların sağlam taksonomik uzmanlığa ve kapsamlı deneyime sahip olmasını gerektirir. Bunların hepsi adli tıp personeline bazı zorluklar getiriyor9. Diatom DNA test teknolojisi, son yıllarda geliştirilen diatom testi için yeni bir teknolojidir 10,11,12. Bu teknoloji, diatomların13,14 spesifik DNA dizisi bileşimini analiz ederek diatomların tür tanımlamasını gerçekleştirir. PCR teknolojisi ve dizileme teknolojisi yaygın olarak kullanılan teknik yöntemlerdir, ancak temelleri DNA'nın diatomlardan başarılı bir şekilde çıkarılmasıdır. Bununla birlikte, diatomların diğer organizmalardan farklı özel bir yapısı vardır, bu da DNA ekstraksiyon tekniklerini de farklı kılar.
Diatomun hücre duvarı yüksek derecede silisleşmeye sahiptir ve ana bileşeni silikon dioksit 15,16,17'dir. Silisli hücre duvarı çok serttir ve DNA'yı çıkarmadan önce yok edilmesi gerekir. Sıradan DNA ekstraksiyon kitlerinin, diatomların18 silisli kabuğunu yok edemedikleri için doğrudan diatom DNA'nın ekstraksiyonu için kullanılması genellikle zordur. Bu nedenle, diatomların silisli kabuğunun yok edilmesi, diatom DNA'sının çıkarılmasında çözülmesi gereken en önemli teknik sorunlardan biridir.
Aynı zamanda, adli araştırma örneklerinde bulunan diatomların sayısı, ister su örnekleri ister boğulmuş cesetlerin organ ve dokuları olsun, genellikle sınırlı olduğundan, diatomları zenginleştirmek gerekir. Zenginleştirmenin özü, maddelerin ayrılmasıdır. Diatomları bir araya getirmeye çalışırken, diğer malzeme bileşenlerinin (enterferans yapan bileşenler) içeriğini en aza indirin. Adli çalışmalarda, laboratuvarlar genellikle diatom hücrelerini ayırmak için santrifüjleme veya membran filtrasyon zenginleştirme yöntemlerini kullanır19. Bununla birlikte, vakum pompalama ekipmanı yaygın olarak kullanılmadığından, membran zenginleştirme yöntemi sıradan birincil adli tıp laboratuvarlarında sıklıkla kullanılmamaktadır. Bu nedenle, santrifüjleme yöntemi hala adli laboratuvarlarda yaygın olarak diatom zenginleştirmedir20.
Diatomlardan DNA ekstraksiyonu şu anda öncelikle adli tıp pratiğinde kullanılmaktadır ve uygulamasında önemli sınırlamalar vardır. Şu anda, piyasada adli bilimlerde kullanılan az sayıda diatom DNA ekstraksiyon kiti bulunmaktadır ve bunlar genellikle pahalıdır21. Bu makale, diatom DNA ekstraksiyonunu basit, kullanışlı ve uygun maliyetli hale getiren gelişmiş bir diatom DNA ekstraksiyon yöntemi sağlar. Bu, diatomların sonraki moleküler biyoloji testlerinin uygulanmasını artırır ve diatom testi yoluyla adli tıpta boğulma ile ilgili sorunları daha iyi çözebilir. Bu yöntem, cam boncuklar ekleyerek ve girdap için uygun bir zaman ayarlayarak diatomların silisli hücre duvarlarını kırar. Bu şekilde proteinaz K ve bağlayıcı çözelti hücreleri hızla parçalar ve hücrelerdeki çeşitli enzimleri etkisiz hale getirir. Genomik DNA, adsorpsiyon kolonundaki matris zarında emilir ve son olarak elüsyon tamponu tarafından ayrıştırılır. Böyle geliştirilmiş bir tam kan geni ekstraksiyon kiti, adli muayene materyallerinde kan kitinin diatom DNA ekstraksiyon etkisini iyileştirir, adli tıp uygulamasında diatom DNA ekstraksiyonunun maliyetini düşürür ve adli araştırmalara daha iyi uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binding Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>rapidly lysing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemoHS qPCR Mix</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007547-120506</td>
			<td>qPCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D512</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109196</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D978</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109197</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>A low-salt elution buffer washes off the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead</td>
			<td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&#160;</td>
			<td>70181000</td>
			<td>Special glass beads for dispersing and grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Import adsorption column</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B2008006022</td>
			<td>Adsorption column with silica matrix membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor Removal Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Removal of Inhibitors in DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Precipitate or isolate DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>R1116175</td>
			<td>real-time fluorescence quantification PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Remove impurities such as cell metabolites</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of diatom dna from water samples and tissues

Diatom testi, adli tıp pratiğinde cesedin suda boğulup boğulmadığını belirlemek ve boğulma yerini belirlemek için önemli bir yardımcı araçtır. Diatom testi aynı zamanda çevre ve plankton alanında da önemli bir araştırma içeriğidir. Birincil araştırma nesnesi olarak diatom DNA'ya odaklanan diatom moleküler biyoloji test teknolojisi, yeni bir diatom testi yöntemidir. Diatom DNA ekstraksiyonu, diatom moleküler testinin temelidir. Şu anda, diatom DNA ekstraksiyonu için yaygın olarak kullanılan kitler pahalıdır ve bu da ilgili araştırmaları yürütme maliyetini artırmaktadır. Laboratuvarımız genel tam kan genomik DNA hızlı ekstraksiyon kitini geliştirdi ve tatmin edici bir diatom DNA ekstraksiyon etkisi elde etti, böylece ilgili araştırmalar için cam boncuklara dayalı alternatif, ekonomik ve uygun fiyatlı bir DNA ekstraksiyon çözümü sağladı. Bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen diatom DNA, PCR ve dizileme gibi birçok aşağı akış uygulamasını karşılayabilir.

In forensic practice, determining whether a corpse found in the water drowning or was thrown into the water after death is essential for the proper resolution of the case1. It is also one of the difficult issues that need to be solved urgently in forensic practice2. Diatoms are abundant in the natural environment (especially in water)3,4. In the process of drowning, due to hypoxia and stress response, people will have intense breathing movements and inhale a large amount of drowning liquid. Therefore, the diatoms in the water enter the lung with the drowning liquid, and some diatoms can enter the blood circulation through the alveolar-capillary barrier and spread to internal organs with the blood flow5,6. The detection of diatoms in internal tissues and organs such as lung, liver, and bone marrow is a strong evidence of drowning before death7,8. Currently, forensic diatom testing is mainly based on morphological testing methods. After a series of pre-digestion of the tissue, the morphological qualitative and quantitative estimations of undigested diatoms are carried out under the microscope. During this period, dangerous and environmentally unfriendly reagents such as nitric acid need to be used. This process is time-consuming and requires researchers to have solid taxonomic expertise and extensive experience. These all bring certain challenges to the forensic staff9. Diatom DNA testing technology is a new technology for diatom testing developed in recent years10,11,12. This technology realizes the species identification of diatoms by analyzing the specific DNA sequence composition of diatoms13,14. PCR technology and sequencing technology are commonly used technical methods, but their basis is the successful extraction of DNA from diatoms. However, diatoms have a special structure different from other organisms, making their DNA extraction techniques also different.
The cell wall of diatom has a high degree of silicification, and its main component is silicon dioxide15,16,17. The siliceous cell wall is very hard, and it must be destroyed before extract the DNA. Ordinary DNA extraction kits are often difficult to use directly for the extraction of diatom DNA because they cannot destroy the siliceous shell of diatoms18. Therefore, destroying the siliceous shell of diatoms is one of the key technical problems to be solved in extracting diatom DNA.
At the same time, since the number of diatoms contained in forensic research samples, whether water samples or organs and tissues of drowned bodies, is often limited, it is necessary to enrich diatoms. The essence of enrichment is the separation of substances. While trying to gather diatoms together, minimize the content of other material components (interfering components). In forensic work, laboratories often use centrifugation or membrane filtration enrichment methods to separate diatom cells19. However, since vacuum pumping equipment is not widely used, the membrane enrichment method is not often used in ordinary primary forensic laboratories. So, the centrifugation method is still commonly diatom enrichment in forensic laboratories20.
DNA extraction from diatoms is currently used primarily in forensic practice, and there are significant limitations to its application. At present, there are few diatom DNA extraction kits used in forensic science on the market and they are generally expensive21. This article provides an improved diatom DNA extraction method, making diatom DNA extraction simple, convenient and cost effective. This increases the application of subsequent molecular biology testing of diatoms and can better solve problems related to drowning in forensic medicine through diatom testing. This method breaks the siliceous cell walls of diatoms by adding glass beads and setting an appropriate time for vortex. In this way, the proteinase K and the binding solution rapidly lyse the cells and inactivate various enzymes in the cells. The genomic DNA is absorbed in the matrix membrane in the adsorption column and finally eluted by the elution buffer. Such an improved whole blood gene extraction kit improves the diatom DNA extraction effect of the blood kit in forensic examination materials, reduces the cost of diatom DNA extraction in forensic practice, and can be better applied to grassroot forensic research.

Yazar Spotlight: Adli Boğulma Muayenesi için Diatom Testi 

Su Örneklerinden ve Dokulardan Diatom DNA'nın Ekstraksiyonu

Our research mainly focus on the topic of drowning. We wanted to answer the question of whether the body found in the water died from drowning, as well to answer another question of where the person fell into the water. That means to know the location of the drowning.Compared with other technologies, we provide a simple, convenient, and economical diatom DNA extraction protocol that we can use better in forensic research, especially in basic forensic practice. Our laboratory will further focus on the drowning related problems based on the pattern in the water, such as reason of death, post mortem interval and so on. What's more, we also carry on the research through the forensic entomology and a some special phenomenons in the tropical forensic medicines.

Şu anda kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemiyle ekstrakte edilen DNA çözeltisi, numunedeki farklı kaynaklardan gelen tüm DNA bileşenlerini içerdiğinden, bu protokolle elde edilen DNA bir istisna değildi. Yani, DNA çözeltisi sadece diatom genomik DNA'nın bir çözeltisi değildi. Diatom 18S rDNA fragmanlarını spesifik olarak çoğaltabilen primerler, literatür 22,23,24'e danışılarak seçilmiştir. Primerler NCB...

Watch this Scientific Journal Video about Diatom Testing for Forensic Drowning Examination at JoVE.com

Bu makale, modifiye edilmiş bir ortak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak diatom DNA ekstraksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Araştırmamız ağırlıklı olarak boğulma konusuna odaklanmaktadır. Suda bulunan cesedin boğularak ölüp ölmediği sorusuna cevap vereceğimiz gibi, kişinin suya nereye düştüğüne dair başka bir soruya da cevap vermek istedik. Bu, boğulma yerini bilmek anlamına gelir.Diğer teknolojilerle karşılaştırıldığında, adli araştırmalarda, özellikle temel adli tıp uygulamalarında daha iyi kullanabileceğimiz basit, kullanışlı ve ekonomik bir diatom DNA ekstraksiyon protokolü sunuyoruz. Laboratuvarımız ayrıca ölüm nedeni, ölüm sonrası aralık vb. gibi sudaki modele dayalı olarak boğulma ile ilgili sorunlara odaklanacaktır. Dahası, adli entomoloji ve tropikal adli tıptaki bazı özel fenomenler aracılığıyla da araştırmayı sürdürüyoruz.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

1.3K Görüntüleme.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). Araştırmamız ağırlıklı olarak boğulma konusuna odaklanmaktadır. Suda bulunan cesedin boğularak ölüp ölmediği sorusuna cevap vereceğimiz gibi, kişinin suya nereye düştüğüne dair başka bir soruya da cevap vermek istedik. Bu, boğulma yerini bilmek anlamına gelir.Diğer teknolojilerle karşılaştırıldığında, adli araştırmalarda, özellikle temel adli tıp uygulamalarında daha iyi kullanabileceğimiz basit, kullanışlı ve ekonomik bir diatom DNA ekstraksiy...