Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2021YJ0175) tarafından desteklenmiştir.

Deneysel protokol ve prosedürler, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi İdari ve Hayvan Araştırma Komitesi'nden onay almıştır (Kayıt numarası: 2022DL-010). 180-200 g ağırlığındaki sekiz haftalık erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kontrollü sıcaklık (23 ± 2 °C) ve bağıl nem (%55 ± %10) ile doğal bir aydınlık/karanlık döngüsü altında barındırıldı. On iki sıçan rastgele iki gruba ayrıldı: kontrol grubu ve AR grubu. Tüm sıçanlar bu koşullara alıştırıldı ve denemeden önce bir hafta boyunca yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı.
1. AR'nin sıçan modelinin kurulması
<ol><li>Hassaslaştırıcı çözeltinin hazırlanması: 30 mg ovalbümin (OVA) ve 3 g Al(OH)3 100 mL salin içinde süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu)14,15.</li>
	<li>Temel duyarlılık: Tamamen uyanık sıçanı karnı yukarı bakacak şekilde kavrayın ve tutun. % 75 alkole batırılmış pamuk topları kullanarak karnı dezenfekte edin. Adım 1.1'de hazırlanan hassaslaştırıcı solüsyonun 1.5 mL'sini AR grubundaki sıçanların sol karın boşluğuna enjekte etmek için 1.5 mL'lik bir şırınga kullanın. Bu enjeksiyonu 14 gün boyunca iki günde bir tekrarlayın (Şekil 1A). NOT: Şırıngayı yerleştirirken kalın ve ince bağırsaklara zarar vermemek için sıçanın kafasının kuyruğundan daha aşağıda olduğundan emin olun. Enjeksiyon bölgesi ventral orta hattan 1,5 cm uzaktadır. Kontrol grubundaki sıçanlar, 14 gün boyunca iki günde bir 1 mL normal salin intraperitoneal enjeksiyonu almalıdır.</li>
	<li>Nazal zorluk: Bazal duyarlılığı takip eden gün 100 μL'lik bir pipet (Şekil 1B) kullanarak burun damlaları yoluyla 50 μL% 5 OVA uygulayın ve bu prosedürü 7 gün boyunca tekrarlayın (Şekil 1C). NOT: 5 g OVA'yı 100 mL salin ile karıştırarak %5 OVA çözeltisini hazırlayın. Kontrol grubu için, aynı hacimde salin damlaları uygulayın.</li>
</ol>2. Sıçanların davranışsal puanlaması
<ol><li>Son burun zorluğunu tamamladıktan sonraki 30 dakika içinde, Tablo 1'de belirtilen puanlama kriterlerine göre burun kaşıma, hapşırma ve burun akıntısı gibi semptomları tanımlamak için bir dijital kamera kullanarak sıçanları gözlemleyin ve kaydedin (Şekil 1D). NOT: Başarılı AR modellemesinin teyidi, toplam ≥5 puan14 elde edilmesine dayanmaktadır.</li>
</ol>3. Burun mukozası örneklerinin alınması
<ol><li>Sıçanları kurban etmek: Sıçanları aşırı dozdaCO2'ye maruz bırakarak kurban edin. Daha sonra, sıçanları% 75 etanol ile dezenfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kas dokusunu ortaya çıkarmak için ağzın iki köşesi boyunca bir kesi yapmak için bir neşter kullanın (Şekil 2A). Daha sonra, doku makası kullanarak kafatasının her iki tarafındaki elmacık kemiğinin ve mandibulanın eklemlerini kesin (Şekil 2B) ve mandibulayı çıkarın (Şekil 2C).</li>
	<li>Burun boşluğuna maruz kalma: burun boşluğunu ortaya çıkarmak için bir hemostat (Şekil 2D) kullanarak maksillanın derisini ayırın (Şekil 2E). Burun boşluğu ile maksilla arasındaki kemik bağlantısını doku makası ile kesin (Şekil 2F). Daha sonra, infraorbital foramende burun boşluğu ile her iki taraftaki orbital kemikler arasındaki bağlantıyı kesin (Şekil 2G) ve burun boşluğunu çıkarın (Şekil 2H).</li>
	<li>Fiksasyon: Çıkarılan burun boşluğunu fiksasyon için% 4 paraformaldehit içine yerleştirin ve 24-72 saat oda sıcaklığında saklayın (bkz. NOT: Kullanılan paraformaldehit fiksatif miktarının, uygun fiksasyon için bölümleri tamamen kaplamaya yeterli olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. Burun mukozası örneklerinin ön işleme tabi tutulması
<ol><li>Dekalsifikasyon: 3.1. adımdan çıkarılan dokuları sabitleyerek başlayın. Her biri 20 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Bunu, her seferinde 20 dakika boyunca damıtılmış suyla üç kez yıkayarak takip edin. Daha sonra, dokuları oda sıcaklığında dokuların 20-30 katı hacme sahip bir dekalsifikasyon solüsyonunda kireçten arındırın.<ol><li>Dekalsifikasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) pH'ı 7.2-7.4 arasında tutmalıdır. Son olarak, kireçten arındırılmış dokuyu bir dehidrasyon kutusuna yerleştirin. NOT: Kireç çözücü solüsyonun haftalık olarak değiştirilmesi gerekir. Dekalsifikasyon işlemi, doku yumuşadığında (yaklaşık 2 ay) sonuçlandırılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Dehidrasyon ve ağda: dehidrasyon kutusunu bir kurutucuya aktarın (bkz. 4 saat boyunca %75 alkolle başlayın, ardından 2 saat boyunca %85 alkol, 2 saat boyunca %90 alkol ve 1 saat boyunca %95 alkol ile başlayın.<ol><li>Daha sonra, dokuyu 30 dakika susuz etanole batırın, işlemi 30 dakika daha tekrarlayın, 5-10 dakika ksilen kullanın, bu adımı 5-10 dakika daha tekrarlayın, dokuyu 1 saat balmumuna batırın, bu adımı bir saat daha tekrarlayın ve son olarak dokuyu 1 saat daha balmumuna batırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Gömme: Erimiş balmumu bloğunu gömme kutusuna yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. Balmumu katılaştığında, çıkarın ve balmumu bloğunu kesin.</li>
	<li>Dilimleme: Kesilmiş balmumu bloğunu bir parafin mikrotomuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 3 μm kalınlığında dilimler halinde kesin. Dilimleri bir slayt yayıcı üzerinde 40 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Dokuyu düzleştirin, ardından bir cam sürgü ile kaldırın ve 60 °C fırında pişirin.<ol><li>Su buharlaştıktan ve balmumu uygun şekilde ayarlandıktan sonra, slaytları çıkarın ve 25 °C sıcaklıkta saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Nazal mukozal dokunun H & E boyaması
<ol><li>Mum alma ve hidrasyon: dilimleri 20 dakika ksilene koyun, işlemi 20 dakika daha, 5 dakika mutlak etanol tekrarlayın, bu adımı 5 dakika daha tekrarlayın, 5 dakika boyunca %75 alkol ve son olarak 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Hematoksilen boyama: 100 μL'lik bir pipet kullanarak 3-5 dakika boyunca 100 μL hematoksilen boyama solüsyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.5 hidroklorik asit etanol ekleyin, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.2 amonyak suyu ekleyin ve 30 saniye durulayın. NOT: Hematoksilen boyamadan sonra, çekirdeğe bağlı ve sitoplazma tarafından emilen aşırı hematoksilen boyasını çıkarmak için% 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşma gereklidir. Eozin boyama yapıldığında, çekirdekler ve sitoplazma açıkça boyanacaktır. % 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşmadan sonra dilimler kırmızı veya pembe görünecektir, bu nedenle farklılaşmayı durdurmak için asidi doku dilimlerinden çıkarmak için farklılaşmadan hemen sonra durulayın. Ardından, nükleer lekelenmeyi arttırmak için% 0.2 amonyak suyu kullanın.</li>
	<li>Eozin boyama: 100 μL eozin boyama solüsyonunu dağıtmak için 100 μL'lik bir pipet kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 dakika ve 30 saniye durulayın.</li>
	<li>Dehidrasyon ve sızdırmazlık: dilimleri 5 dakika mutlak etanole batırın, işlemi 5 dakika daha tekrarlayın, bir kez daha 5 dakika, dimetil 5 dakika ve ksileni 5 dakika tekrarlayın. Son olarak, nötr reçine ile kapatın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Lekeli bölümün mikroskoba yerleştirilmesi: lekeli bölümü mikroskoba yerleştirin, görüntü net bir şekilde görünene kadar mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.</li>
</ol>6. Nazal mukozal dokunun çok renkli immün boyaması
<ol><li>Mum alma ve nemlendirme: adım 5.1'de belirtilenin aynısını izleyin.</li>
	<li>Sitrat-fosfat tampon işlemi: sitrat-fosfat tamponunu (pH 6.0) ( Malzeme Tablosuna bakınız) mikrodalgaya dayanıklı bir kaba koyun. Kaynayana kadar ısıtın, çıkarın ve ardından slaytları kaba ekleyin. Kaynayana kadar 8 dakika orta ateşte mikrodalga, 8 dakika ısıyı kapatın ve ardından 7 dakika orta-düşük ısıya geçin.<ol><li>Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) aktarın, çalkalayın ve her seferinde 5 dakika boyunca renk giderici bir çalkalayıcı kullanarak üç kez yıkayın. NOT: Bu işlem sırasında tamponun buharlaşmadığından emin olun ve dilimlerin kurumasını önleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Endojen peroksidazı bloke etme: dilimleri kurutun, immünohistokimyasal bir kalemle dokunun etrafına bir daire çizin (antikorun akmasını önlemek için) ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın (hidrojen peroksit: saf su = 1: 9).<ol><li>Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Engelleme: Daire içine %5 keçi serumu uygulayın ve 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikor ilavesi: bloke edici çözeltiyi yavaşça çıkarın, dilime FOXP3 (seyreltme: 1:200, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve nemli bir odaya yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. NOT: Antikor buharlaşmasını önlemek için nemli odaya az miktarda su ekleyin.</li>
	<li>İkincil antikor ilavesi: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri nazikçe kurutun ve ikincil antikoru (Keçi Anti-Tavşan IgG H & L, bkz. Malzeme Tablosu) daire içine uygulayın. Karanlıkta 50 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.</li>
	<li>Tiramid seyreltme çözeltisinin hazırlanması: 100 μL %3H2O2'yi100 mL 1x TBST ile birleştirin (bkz.</li>
	<li>TSA çalışma çözeltisinin eklenmesi: TSA çalışma çözeltisini hazırlamak için 1 mL Tiramid seyrelticiyi 2 μL CY3-Tiramid ile karıştırın. Her dilime 100 μL TSA çalışma solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Ardından, dilimleri PBS ile her seferinde 5 dakika olmak üzere üç kez yıkayın. NOT: TSA çalışma solüsyonunu hemen hazırlayıp kullanın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın; 24 saate kadar geçerlidir.</li>
	<li>Adım 6.2-6.8'i tekrarlayın: 1:200 RORγt (FITC floresan boya) seyreltmesine ve ardından 1:200 TICAM1 (TYP620 boya) seyreltmesine geçin (bkz.</li>
	<li>DAPI karşı boyalı çekirdekler: dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın, DAPI boyama solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Söndürme otofloresansı: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Otofloresan söndürücüyü ( Malzeme Tablosuna bakınız) dilimlere uygulayın, 5 dakika bekleyin ve ardından 10 dakika yıkayın.</li>
	<li>Engelleme: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın ve floresan önleyici söndürücü ile kapatın (bkz.</li>
	<li>Mikroskopi: lekeli bölümü mikroskobun üzerine yerleştirin, net görünürlük için mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 20x ve 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın. NOT: DAPI, 330-380 nm UV uyarma dalga boyuna ve 420 nm (mavi ışık) emisyon dalga boyuna sahiptir. FITC, 465-495 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 515-555 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (yeşil ışık) sahiptir. CY3, 510-560 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 590 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (kırmızı ışık) sahiptir. TYP-690, 630 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 690 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (pembe ışık) sahiptir.</li>
</ol>

Allerjik rinit sıçan modelinde burun dokusunun çok renkli immünofloresanı

<ol>
	<li>Bro&#380;ek, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+rhinitis+and+its+impact+on+asthma+(ARIA)+Guidelines-2016+revision.">Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).</li><li>Maurer, M., Zuberbier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undertreatment+of+rhinitis+symptoms+in+Europe:+findings+from+a+cross-sectional+questionnaire+survey.">Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey.</a> Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-linolenic+acid+improves+nasal+mucosa+epithelial+barrier+function+in+allergic+rhinitis+by+arresting+CD4++T+cell+differentiation+via+IL-4R&#945;-JAK2-STAT3+pathway.">Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4R&#945;-JAK2-STAT3 pathway.</a> Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NLRP3+inflammasome+contributes+to+the+inflammatory+response+to+allergic+rhinitis+via+macrophage+pyroptosis.">Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis.</a> International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).</li><li>Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+allergic+inflammation+in+the+nasal+mucosa+of+allergic+rhinitis+sufferers+with+topical+pharmaceutical+agents.">Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents.</a> Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).</li><li>Patel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+extracts+stimulate+solitary+chemosensory+cell+expansion+in+noninvasive+fungal+rhinosinusitis.">Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1(+)CD8(+)+T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoua, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-ex+pressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Fedchenko, N., Reifenrath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+approaches+for+interpretation+and+reporting+of+immunohistochemistry+analysis+results+in+the+bone+tissue+-+a+review.">Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review.</a> Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).</li><li>Faget, L., Hnasko, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+immunofluorescent+enhancement.">Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).</li><li>Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+faces+of+programmed+cell+death+ligand+1+expression+in+malignant+and+nonmalignant+cells.">The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).</li><li>Welsh, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+estrogen+receptor+measurement+in+breast+cancer+suggests+false-negative+results+are+a+function+of+threshold+intensity+rather+than+percentage+of+positive+cells.">Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+for+preparation+of+allergic+rhinitis+animal+model+(draft).">Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft).</a> Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astragalus+polysaccharides+attenuate+ovalbumin-induced+allergic+rhinitis+in+rats+by+inhibiting+nlrp3+inflammasome+activation+and+nod2-mediated+nf-+&#954;+b+activation.">Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- &#954; b activation.</a> Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).</li><li>Bousquet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+rhinitis.">Allergic rhinitis.</a> Nature reviews. 6 (1), 95 (2020).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+activated+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+as+a+predictive+and+prognostic+marker+in+advanced+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma.</a> World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).</li><li>Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perennial+rhinitis:+An+independent+risk+factor+for+asthma+in+nonatopic+subjects:+results+from+the+European+Community+Respiratory+Health+Survey.">Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).</li><li>Guerra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhinitis+is+an+independent+risk+factor+for+developing+cough+apart+from+colds+among+adults.">Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults.</a> Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).</li><li>Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-existence+of+asthma+and+allergic+rhinitis:+a+23-year+follow-up+study+of+college+students.">Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students.</a> Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).</li><li>Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+on+the+pathomechanisms+of+allergic+rhinitis.">Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis.</a> Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).</li><li>Van Nguyen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-allergic+rhinitis+activity+of+&#945;-lipoic+acid+via+balancing+th17/treg+expression+and+enhancing+nrf2/ho-1+pathway+signaling.">Anti-allergic rhinitis activity of &#945;-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+ror&#947;t+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor ror&#947;t directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+the+transcription+factor+Foxp3+leads+to+the+generation+of+pathogenic+memory+T+cells+in+Vivo.">Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo.</a> Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).</li><li>Ziegler, S. F., Buckner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+the+regulation+of+Treg/Th17+differentiation.">Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation.</a> Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).</li><li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis.">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li><li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis.">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li><li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis.">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues.">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Allerjik Rinit (AR), çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklanan burun mukozasının enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İş verimliliğini etkileyen, yaşam kalitesini düşüren, uykuyu, bilişsel işlevi bozan, sinirlilik ve yorgunluğa neden olan küresel bir sağlık sorunu haline geldi. AR, dünya nüfusunun %10-20'sini¹ etkilemekte ve önemli ekonomik maliyetler taşıyarak AB ülkelerinde yıllık 30-50 milyar avroya varan kayıplara neden olmaktadır18...

Allerjik rinit (AR), primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE)1,2'nin aracılık ettiği burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. Hapşırma, burun akıntısı, burun tıkanıklığı ve burun kaşıntısı gibi semptomlarla karakterizedir. Sanayileşme ve kentleşme ile birlikte, AR prevalansı giderek artmakta ve dünya nüfusunun yaklaşık %10-20'sini etkilemektedir1. İmmünofloresan (IF) tekniği, bir antikor-antijen bağlanma reaksiyonu kullanan bir floresan boyama yöntemidir. Biyolojik dokularda veya hücrelerde spesifik proteinlerin dağılımını ve ekspresyon seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılabilir. AR araştırmasında IF, AR ile ilişkili sitokinler, inflamatuar hücreler, reseptörler ve daha fazlası dahil olmak üzere birden fazla hedefi aynı anda tespit edebilir ve AR patogenezinin ve ilaçların etkilerininaraştırılmasını kolaylaştırır 3,4,5,6.
Çok renkli immünofloresan (mIF) boyama işlemi, her boyama turu sırasında bir antikor elüsyon adımının eklenmesiyle geleneksel IF'ye çok benzer. Bu modifikasyon, sıralı tek etiketleme ve çoklu yeniden boyama turları yoluyla aynı doku kesitinde birden fazla biyobelirteçin aynı anda saptanmasını sağlar. mIF, tiramid sinyal amplifikasyonuna (TSA) dayanır ve tekrarlanan TSA floresan boyama döngülerine ve floresan sinyallerinikorurken antikorları uzaklaştırmak için mikrodalga ısıtmanın kullanılmasına izin verir 7,8. Konvansiyonel IF ile karşılaştırıldığında, mIF çeşitli avantajlar sunar: (1) konvansiyonel IF 9,10 ile tanımlanması zor olan zayıf eksprese edilmiş antijenleri tespit edebilir; (2) geliştirilmiş sinyal-gürültü oranı ile yüksek kaliteli boyama sağlar; (3) dokuya özgü yapıların ve ilgilenilen bölgelerin nicelleştirilmesine izin verir11; (4) çoklu yolakların çoğullanması, dokuları verimli bir şekilde kullanır ve sınırlı patolojik kaynakları korur12; (5) mIF aracılığıyla çok parametreli analiz, gizli biyolojik bilgileri ortaya çıkararak dokular hakkında daha derin bilgiler sunar13.
Genel olarak, mIF, aynı numune içinde farklı antijen ekspresyonlarının ve dağılımlarının gözlemlenmesine izin vererek hedef proteinlerin incelenmesini kolaylaştırır. Gelecekte, çoklu hedef proteinlerin ekspresyonunu ve dağılımını anlamak isteyen araştırmacılar bu tekniği değerli bir seçim olarak göreceklerdir. Bu çalışma, sıçanlardan alınan nazal mukoza örneklerinin AR ile boyanması için mIF'nin uygulanmasını göstermekte ve bir AR sıçan modelinin oluşturulmasını değerlendirmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Al(OH)3</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td>
			<td>20210107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021070101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescence quenching sealer</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic dyeing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Varistain Gemini ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier slides</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-phosphate buffer&#160;</td>
			<td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)</td>
			<td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>CS01-2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1223-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring shaker</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>S1010E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA decalcification solution</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CR2203047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating blast dryer&#160;</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding box marking machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>&#160;PrintMate AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast tissue dewatering machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>STP420 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film sealer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Autostainer 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1222-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Sunny Optical Technology Co.Ltd</td>
			<td>CX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>bs-10211R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing table</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Liankebio Co., Ltd</td>
			<td>GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DH0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td>
			<td>210608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical pen</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BC004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Midea</td>
			<td>M1-L213B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral gum</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A804010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>D1008E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology section scanner</td>
			<td>3DHISTECH Kft</td>
			<td>Pannoramic SCAN&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>KE0003087/KA0056573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ror&#947;t</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF3196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td>
			<td>20170022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B</td>
			<td>Bioengineering Co., Ltd</td>
			<td>A602008-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>PC2-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rats</td>
			<td>Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine</td>
			<td>SYX <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 2023-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TICAM-1</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF6289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J22120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue spreading baking sheet machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR-690 fluorescent dyes</td>
			<td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RC0086-34RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>SLK-O3000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath-slide drier</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax trimmer</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JXL-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022051901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling in nasal mucosa tissue sections of allergic rhinitis rats via multicolor immunoassay

Allerjik rinit (AR), dünya nüfusunun yaklaşık %10-20'sini etkileyen, primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE) aracılık eden, burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İmmünofloresan (IF) boyama, hastalığa özgü protein ekspresyonunu tespit etmek için uzun süredir standart bir teknik olsa da, geleneksel IF teknikleri, aynı numunedeki üç veya daha fazla proteinin ekspresyon seviyelerini tespit etme yeteneklerinde sınırlıdır. Sonuç olarak, son yıllarda, hücrelerde veya dokularda birden fazla hedefin aynı anda etiketlenmesine izin veren çok renkli IF teknikleri geliştirilmiştir.
Bu protokol, bir AR sıçan modeli oluşturma, nazal mukozal örneklerin alınması ve çok renkli immünofloresan için teknik prosedürler için kapsamlı bir genel bakış sağlar. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi ve davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama, AR grubunda artmış inflamatuar hücre sayısı ve bozulmuş nazal mukozal bütünlük ortaya çıkardı. Çok renkli immünofloresan (mIF), RORγt ve TICAM-1 ekspresyonunun arttığını gösterirken, AR sıçanlarının burun mukoza dokusunda Foxp3 ekspresyonu azaldı.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE)1,2. It is characterized by symptoms such as sneezing, a runny nose, nasal congestion, and nasal itching. With industrialization and urbanization, the prevalence of AR is gradually increasing, affecting approximately 10%-20% of the world&#39;s population1. The immunofluorescence (IF) technique is a fluorescent staining method that utilizes an antibody-antigen binding reaction. It can be employed to detect and quantify the distribution and expression levels of specific proteins in biological tissues or cells. In AR research, IF can simultaneously detect multiple targets, including AR-related cytokines, inflammatory cells, receptors, and more, facilitating the exploration of AR pathogenesis and the effects of drugs3,4,5,6.
The multicolor immunofluorescence (mIF) staining process closely resembles traditional IF, with the addition of an antibody elution step during each round of staining. This modification enables the simultaneous detection of multiple biomarkers on the same tissue section through sequential single-labeling and multiple rounds of re-staining. mIF is based on tyramide signal amplification (TSA), allowing for repeated cycles of TSA fluorescent staining and the use of microwave heating to remove antibodies while retaining fluorescent signals7,8. In comparison to conventional IF, mIF offers several advantages: (1) it can detect weakly expressed antigens that are challenging to identify with conventional IF9,10; (2) it provides high-quality staining with an improved signal-to-noise ratio; (3) it allows for the quantification of tissue-specific structures and regions of interest11; (4) multiplexing multiple pathways efficiently utilizes tissues and conserves limited pathological resources12; (5) multi-parameter analysis through mIF offers deeper insights into tissues, uncovering hidden biological information13.
Overall, mIF allows the observation of different antigen expressions and distributions within the same sample, facilitating the study of target proteins. In the future, researchers seeking to understand the expression and distribution of multiple target proteins will find this technique a valuable choice. This study demonstrates the application of mIF for staining nasal mucosa samples from rats with AR and evaluate the establishment of a rat model of AR.

Yazar Spotlight: Çok Renkli İmmünofloresan ile Alerjik Rinit Araştırmalarını İlerletmek

Allerjik Rinit Sıçanlarının Nazal Mukoza Dokusu Kesitlerinde Çok Renkli İmmünoassay ile İmmünofloresan Etiketleme

Our main research is based on a study of allergic rhinitis. Our research intends to analyze what proteins are associated with allergic rhinitis. Multicolor immunofluorescence is currently used to advance research in our field.In future studies, we will focus on the possible mechanisms of TCM in the treatment of allergic rhinitis.

Altı SD sıçan, OVA intraperitoneal enjeksiyon ve nazal zorlama yoluyla AR modeline başarılı bir şekilde indüklendi. AR, AR grubundaki tüm sıçanlarda indüklendi ve grubun% 100'ünü oluşturdu. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi. Tüm davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı (Tablo 2).
Modellemenin 21. günündeki H & E boyama sonuçları, kontrol sıçanlarında, burun mukoza...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Allergic Rhinitis Research with Multicolor Immunofluorescence at JoVE.com

Bu protokol, alerjik rinitin sıçan modelini değerlendirmek için çok renkli bir immünofloresan tekniğini açıklar.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Ana araştırmamız alerjik rinit çalışmasına dayanmaktadır. Araştırmamız, hangi proteinlerin alerjik rinit ile ilişkili olduğunu analiz etmeyi amaçlamaktadır. Çok renkli immünofloresan şu anda alanımızdaki araştırmaları ilerletmek için kullanılmaktadır.Gelecekteki çalışmalarda, alerjik rinit tedavisinde TCM'nin olası mekanizmalarına odaklanacağız.

immunofluorescent-labeling-nasal-mucosa-tissue-sections-allergic

Research

JoVE Journal

Medicine

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

1.1K Görüntüleme.  Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Ana araştırmamız alerjik rinit çalışmasına dayanmaktadır. Araştırmamız, hangi proteinlerin alerjik rinit ile ilişkili olduğunu analiz etmeyi amaçlamaktadır. Çok renkli immünofloresan şu anda alanımızdaki araştırmaları ilerletmek için kullanılmaktadır.Gelecekteki çalışmalarda, alerjik rinit tedavisinde TCM'nin olası mekanizmalarına odaklanacağız.

Video: Yazar Spotlight: Çok Renkli İmmünofloresan ile Alerjik Rinit Araştırmalarını İlerletmek

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), affecting approximately 10%-20% of the world's population. While immunofluorescence (IF) staining has long been a standard technique for detecting disease-specific protein expression, conventional IF techniques are limited in their ability to detect the expression levels of three or more proteins in the same sample. Consequently, multicolor IF techniques have been developed in recent years, which allow the simultaneous labeling of multiple targets in cells or tissues.
This protocol provides a comprehensive overview of the process for establishing a rat model of AR, obtaining nasal mucosal samples, and the technical procedures for multicolor immunofluorescence. All rats in the AR group exhibited typical symptoms such as sneezing, a runny nose, and an itchy nose, with behavioral observations scoring &#8805;5 points. Hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining revealed increased inflammatory cell counts and disrupted nasal mucosal integrity in the AR group. Multicolor immunofluorescence (mIF) demonstrated increased expression of ROR&#947;t and TICAM-1, while Foxp3 expression decreased in the nasal mucosa tissue of AR rats.

This protocol describes a multicolor immunofluorescence technique for evaluating the rat model of allergic rhinitis.

Tıp

Acquisition and Pre-Processing of Nasal Mucosal Samples from Rats with Allergic Rhinitis

To begin, with a scalpel, make a precise incision along the two corners of the mouth of a euthanized rat to expose the muscle tissue. Use a pair of tissue scissors to cut the joints of the zygomatic bone and the mandible on both sides of the skull. Then remove the mandible.Use tissue scissors to cut the bony connection between the nasal cavity and the maxilla. Then use a hemostat to separate the skin of the maxilla to expose the nasal cavity. Sever the connection between the nasal cavity and the orbital bones on both sides at the infraorbital foramen, and remove the nasal cavity.Place the extracted nasal cavity in a 4%Paraformaldehyde solution for fixation. To decalcify the tissue, wash the fixed tissue with distilled water. Place the tissues in a decalcification solution with a volume 20 to 30 times that of the tissues at room temperature.Once decalcification is complete, place the tissue in a dehydration box. Transfer the dehydration box to a dehydrator and dehydrate the tissue in increasing alcohol concentrations at different incubation times. Next, place the tissue in anhydrous ethanol for 30 minutes for two cycles.Following this, transfer the tissue to xylene for five to 10 minutes and repeat, then immerse the tissue in wax for one hour. Place the wax block in embedding cassettes. Remove the wax blocks after they have solidified and trim the wax block.Insert the trimmed wax block into a paraffin microtome and cut it into three micrometer thick slices. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.

Allerjik Rinitli Sıçanlardan Nazal Mukozal Örneklerin Alınması ve Ön İşleme Alınması

Multicolor Immunostaining of Nasal Mucosal Tissues of Rats with Allergic Rhinitis

To begin, place the hematoxylin and eosin stained rat nasal mucosal tissue sections onto a microscope stage. Adjust the microscope's focus until the image is clearly visible. Capture the tissue image at 40X.Heat the citrate phosphate buffer until it boils. Then add the slides to the container after removing it from the heat. After heating for eight minutes until boiling, turn off the heat for eight minutes and subsequently switch to medium low heat for seven minutes.After allowing the container to cool naturally transfer the slices to PBS. Use a decolorizing shaker to shake the slices for five minutes. Next draw a circle around the dried tissue with an immunohistochemical pen.Add 3%hydrogen peroxide solution to the slices before incubating. Then transfer the slices to PBS for washing as before. To block, apply 5%goat serum within the marked circle.After incubation, carefully remove the blocking solution and add one to two milliliters of FOXP3 to the tissue slices. Then place the slices in a humid chamber for overnight incubation. After washing the slices in PBS, gently dab the slices dry with filter paper.Then add one to two milliliters of the secondary antibody solution to the slices. Next incubate the slices in 100 microliters of tyramide signal amplification working solution for 10 minutes at room temperature in the dark. After incubation, wash the slices with PBS three times for five minutes each.Now apply one to two milliliters of DAPI staining solution to the slices before incubation. Quench the auto fluorescence by incubating the slices in the quencher for five minutes before a 10 minute PBS wash. Then seal them with the anti fluorescence quencher.Capture the microscopic images of the stained sections under 20X and 40X magnification. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged epithelial cells and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.Multi immunofluorescent staining revealed that the expressions of ROR Gamma T and TCAM1 were increased in the disease group. However, FOXP3 was under expressed.