Bu çalışma, senkronize elektrokardiyogram kaydı ile birlikte in vivo kalsiyum görüntüleme için anestezi uygulanmış farelerde torasik DRG'yi ortaya çıkarmak için cerrahi bir manipülasyon başlattı. Bunu yaparak, foramen üzerindeki PC6'daki akupunkturun DRG nöronunu aktive edip edemeyeceğini ve aynı anda elektrokardiyogramı düzenleyip düzenleyemeyeceğini cevaplamaya çalışıyoruz. Şu anda akupunktur çalışmalarında kullanılan teknikler arasında in vivo veya vitro elektrofizyoloji, nöral izleme ve optogenetik ve kemogenetik ile birleştirilmiş çeşitli stratejiler bulunmaktadır.
Bu çalışmada tanıtılan in vivo kalsiyum görüntüleme, akupunkturun neden olduğu DRG nöron popülasyonlarının aktivitelerini, tümü farklı hayvan modellerinde, dinamik ve gerçek zamanlı kayıtlar yoluyla daha iyi anlamaya yardımcı olur. Torasik omurganın torasik bir ila beş vertebral segmentteki fizyolojik eğriliği nedeniyle, torasik DRG'lerin ortaya çıkarılması oldukça zordur. Ayrıca, kardiyak ve pulmoner ritimlerin etkileri, torasik DRG'lerin fiksasyonunu zorlaştırmaktadır.
Aksi takdirde, solunum anestezisi ve farelerin saatlerce durum bakımı kolay değildir. İn vivo kalsiyum görüntüleme, genetik mühendisliği fareleri kullanarak belirli nöron popülasyonlarının aktivitesini ortaya çıkarır. Bu, torasik DRG nöronlarının in vivo olarak ilk kez gözlemlenmesidir.
Bu yaklaşım, somatik veya viseral stimülasyonlar tarafından üretilen nöronal aktivitelerin yanı sıra bunların karışmalarının gözlemlenmesini gerçekleştirir. Laboratuvarımız, torasik ve lomber DRG'nin in vivo kalsiyum görüntülemesi için yöntemler geliştirmiştir ve gelecekte, akupunkturun başlatıcı faktörleri, accupoints'in aşırı duyarlılığı, somatik akupunktur stimülasyonu ve viseral girdiler arasındaki etkileşimler ile ilgili reseptörleri gözden geçireceğiz. Anestezi uygulanmış bir fare üzerinde trakeotomi yaptıktan sonra, fareyi ısıtılmış bir ped üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin.
Boynun ense ortasında, servikal altıdan torasik üç omurlara kadar uzanan iki santimetre uzunlamasına bir kesi yapın. Farenin torasik omurlarının ön tarafındaki yağ ve kış uykusu bezlerini, bezlerin altındaki kan damarlarından kaçınarak dikkatlice ayırın. Trapez kası da dahil olmak üzere cilt ve kas katmanlarını kesmek için yaylı makas kullanın.
Daha fazla maruz kalmaya yardımcı olmak için kaslar arasına bir ekartör yerleştirin. Baş kelepçesine ve uzun boyun kaslarının düz kısmına bağlanan kasları çıkarın, torasik ikinin dikenli süreçlerini açığa çıkarın. Vertebra kemerini C6'dan T3'e çıkarmak için semispinalis ve spinalis kaslarını yerinden çıkarın. Vertebra ark plakası ile torasik olanın eklem süreci arasındaki bağlantıyı kesin.
Torasik olanın sol ve sağ eklem süreçlerini ve memeli süreçlerini titizlikle çıkarmak için ince forseps kullanın. Üstteki bağ dokusunu temizleyin. Epinuriumun seçilen taraftaki bütünlüğünü sağlamak için sol veya sağ torasik bir dorsal kök ganglionunu veya DRG'yi dikkatlice ortaya çıkarın.
Nemi korumak için açıkta kalan DRG'nin üzerine ılık tuzlu suya batırılmış küçük bir pamuk topu yerleştirin. EKG monitörünü sağ üst ekstremitedeki negatif kutbu, sağ alt ekstremitedeki topraklama kablosu ve sol alt ekstremitedeki pozitif kutbu bağlayın. Fareyi bir ısıtma yastığı ile özel omurga kelepçesinin sahnesine yerleştirin.
Fareyi, servikal altı ve torasik üç'ün eklem işlemlerine bağlı iki klips kullanarak sabitleyin. Spinal kelepçeyi güvenli fare ile konfokal mikroskop altında konumlandırın. 10x/0.32 uzun çalışma mesafeli hava objektifini açıkta kalan torasik 1 DRG'nin üzerine yerleştirin.
Adım boyutunu 25 mikrometre ve 512 x 512 veya 1.024 x 1.024 piksel çözünürlüğe ayarlayın. Aşama z eksenini yukarı ve aşağı ayarlayın ve tüm torasik 1 DRG'yi yakalayın. Farenin üst ekstremitesine fırça stimülasyonu uygulayın ve görüntülenen DRG nöronlarının yanıt verebilirliğini değerlendirin.
Bir stimülatör kullanarak PC6 stimülasyonunda periferik sinir stimülasyonları gerçekleştirin. Başlangıç koşulları altında, torasik 1 DRG'deki nöronların çoğu GFP floresansı göstermedi. Somatik stimülasyon, GFP'nin sayısında ve yoğunluğunda bir artış ile GCaMP floresansında hızlı ve geçici bir artışa neden oldu.
PC6 uygulamasındaki periferik sinir stimülasyonları, GCaMP floresansında somatik stimülasyona benzer değişikliklere neden oldu. Nöronlar, görüntüleme yazılımı ile izlendikten sonra tek bir torasik 1 DRG içinde işaretlendi ve numaralandırıldı. F0 eşiğinin %130'unu aşan floresan yoğunluğu değişiklikleri gösteren nöronlar pozitif yanıtlar olarak kabul edildi.
Histogram, PC6'da periferik sinir stimülasyonlarına yanıt veren farklı nöron çaplarını gösterdi. PC6 stimülasyonunda periferik sinir stimülasyonları kalp hızında artış gösterdi.
