We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

Bütün hayvanlar Danimarka ve Avrupa yönetmeliklerine tam uyum içinde ele alınmıştır. İzin numarası: 2012-15-2934. Omurilik Hidrolik eldesi için Şırınga 1. Hazırlık <ol><li> bir yetişkin farenin, bir 10 ml şırınga kullanın. Yetişkin fare için, 5 ml şırınga kullanın. Yavruların için, 2.5 ml şırınga kullanın. </li><li> o şırıngaya sıkıca oturana kadar pipet büyük ucunu kırparak 2-200 uL pipetler için evrensel uygun olmayan bir filtre pipet ayarlayın. şırınga düzeltilmiş pipet yerleştirin. Yavruların için ayarlanmış bir pipet yerine 23 G veya benzeri iğne kullanın. </li><li> Aspire buz soğukluğunda steril PBS ve sonraki kullanıma kadar buz üzerinde şırınga bırakın. </li></ol> 2. Ötenazi <ol><li> Bu imkansız ekstrüzyon render sırt omurgasını rahatsız edecek şekilde, servikal dislokasyon yapmayın. </li><li> Yetişkin sıçan / fare için, örneğin CO 2 veya isoflu olarak gaz kullanılarak euthanizerane. Bu maddeler zararlıdır. Davlumbaz ötanazi gerçekleştirin ve kurum yönergelerine göre maddeleri işlemek. (DİKKAT: CO 2: H280, P410, P403; izofluran: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> kemirgen ölü olduğundan emin olmak için, cımbız ile bir pençe sıkıştırarak refleksinin yokluğu sağlamak. Büyük makas kullanılarak kemirgen başını kesmek. Yavruların için, boyunları vurularak euthanize. </li></ol></li></ol> Spinal sütun 3. İzolasyon <ol><li> saç kontrol etmek için kürk üzerine su serpin. </li><li> makas kullanılarak, bir uzak doğrultuda omurga boyunca kürk kesilerek açılır ve pelvis kemiği, son omurga boyunca her iki tarafta da kesilerek omuriliğe izole eder. bir makas ile pelvis kemiğinin distalinde omuriliği kesin. NOT: rostral-kaudal eksen protokol boyunca proksimal-distal ekseni olarak gösterilir. <ol><li> proximal- önlemek için bir makas kullanarak omuriliğe Trimbunlar gibi en distal-çoğu alanlarda çok başarılı omurilik ekstrüzyon için S-şekilli omuriliğe hale getirebilir. Omurilik iki ucunda görünür olduğundan emin olun. Omurilik görünür değilse omurilik görünür hale gelinceye kadar, makasla omurga düzeltin. </li></ol></li></ol> Omurilik 4. Hidrolik eldesi <ol><li> Buz üzerinde, steril PBS ile doldurulmuş bir petri çanağı (100 mm çapında) yerleştirilir. </li><li> böylece mümkün olduğunca fazla omurga düzleştime, omurganın bükük kısmı (proksimal-en sonu) bir parmağı uygulanarak omuriliğe düzleştirin. <ol><li> Omurlar imkansız omurilik ekstrüzyon render bozulacak şekilde yavruların için, omurga eğilmesini önlemek. </li></ol></li><li> pipet omurganın uzak-en sonunda (yavruların 23 G iğne, yetişkin fareler için alternatif 18 G iğne) yerleştirin. doğru takılmış ise, ucu omurilik boşluğuna stabilize edilir. </li><li> omurga mümkün olduğu kadar düzleştirilmiş olduğundan emin olun. sabit bir basınç uygulayın ve buz üzerinde Petri kabı içine omurilik a&#39;ya. Omurilik daha sonraki işlemler kadar PBS içinde tutarak buz üzerinde nemli tutulan olduğundan emin olun. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Şekil 1: Temsilci omurilik. Hidrolik omurilik presten. yetişkin sıçan, yetişkin fare, fare yavru: Soldan sağa. Lomber büyütme kutu ile işaretlenmiş. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Dorsal Kök Ganglia 5. Tanımlama (DRG) <ol><li> makas kullanılarak iki eşit uzunlamasına parça omurga bölünmüş ve mikroskop altında bölünmüş omuriliğe yerleştirin. </li><li> tarafından T13 vertebra segmenti tanımlamak<html> omurga ödeyen dikkat distal-en costadan bağlanma sitesini yerini yakın interkostal sinirler ile costae şaşırtmak için değil. Distal-en costae proksimal T13 vertebra segmenti parçası ve T13 DRG L1 vertebra için distal vertebra T13 ve proksimal bulunduğu bağlıdır. </li><li> uzak yönde birlikte DRG&#39;ler tanımlar. Yetişkin bir sıçan için, eşlik eden DRG açıkça görülebilir dorsal ve ventral kökleri beyaz görünür. Yetişkin bir fare için, eşlik eden DRG açıkça görülebilir dorsal ve ventral kökleri beyaz görünür. Yavruların için, eşlik eden DRG net küreler görünür. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Şekil 2: omuriliğin ekstrüzyon sonrası omurga TİG&#39;lerin tanımlanması. omurga oklarla gösterildiği gibi TİG&#39;lerin görselleştirme izin bölünmüş edilmiştir. Yetişkin sıçan ve fare yavru ile örneklenen.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. DRG&#39;ler 6. İzolasyonu <ol><li> Belirli DRG&#39;lerde göre Sayı Petri kapları (çapı 30 mm), örneğin L3, L4, L5, izole edilmesi. buz gibi soğuk steril PBS ile Petri kapları doldurun ve buz üzerine koyun. </li><li> DRG&#39;ler zarar kaçınarak mümkün olduğunca DRG&#39;lerde yakın mikro makas, kesip dorsal ve ventral kökleri kullanarak onları serbest bırakmak için. </li><li> Kapalı cımbız ucu ile hafifçe DRG&#39;ler kepçe ve ilgili sayılı Petri aktarabilirsiniz. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Şekil 3: Temsilci DRG&#39;ler izole edilmiştir. yetişkin sıçan, yetişkin fare, fare yavru: Soldan sağa.&quot;_blank&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Daha fazla Analizi Doku 7. İşleme <ol><li> Western lekeleme <ol><li> Omurilik lomber genişleme örneğin, ilgi doku alanını izole edin. Gerekirse, ipsilateral ve kontralateral tarafta içine ve daha dorsal ve ventral boynuz içine omurilik ayırın. </li><li> Bu buz üzerinde uygun bir enzim inhibitörleri ihtiva eden (iki kez damıtılmış H2 O, 10 mM Tris-baz, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA,% 1 NP40) TNE parçalama tamponu gibi liziz tamponu içinde doku yerleştirin. </li><li> mekanik öğütme havaneli kullanılarak buz üzerinde yaklaşık 30 saniye boyunca doku homojenize edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj ve standart protokoller 5, 6&#39;ya uygun daha fazla işlem için süpernatan kullanmak ya da daha fazla, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de süpernatan tutun. </li></ol></li><li> RNA analizi <ol><li> ilgi doku izole. </li><li> Hemen depolama RNA&#39;yı stabilize RNA stabilizasyonu solüsyon içerisinde dokuyu yerleştirin. </li><li> Standart protokollere 7&#39;ye göre RNA izole. </li><li> CDNA RNA dönüştürmek ve standart protokoller 7&#39;ye göre qPCR gerçekleştirin. </li></ol></li><li> immünohistokimya <ol><li> (Omurilik için geçerlidir) taze donmuş dokular için: <ol><li> toz, iki çorba kaşığı tekabül eden bir miktarda kuru buz küpleri toz haline kuru buz tozu hazırlamak. Bir bez kuru buz küpleri Kapak ve bir çekiç kullanarak küpleri pulverize. Kuru buz bir tabakası üzerinde gümüş folyo (yaklaşık 5 cm x 5 cm) yerleştirilir ve kuru buz tozu gümüş folyo kapağı. </li><li> cımbız kullanarak kuru buz tozu ile ilgili daha fazla analiz için seçilen omurilik alanını yerleştirin, bu ek bileşenini donma ve cryo tüp omurilik transfer edelim. her zaman kuru buz üzerinde tutun ya da bizi daha da kadar -80 ° C saklayıne. </li><li> Bir kriostada omurilik aktarın (-20 ° C). Gerekirse, kriyostat içinde omurilik kırpın. örnek diske bağlamak için kriyostat içinde gömülü malzemenin içinde omuriliği yerleştirin. </li><li> Örneğin 5 mikron, istenilen kalınlıkta omuriliği kesilmiş ve cam plakalar üzerinde toplamak. Daha iyi eki için doku koleksiyonuna hemen önce bir parmak ile cam plakalar ısıtın. sonraki kullanıma kadar -80 ° C &#39;de kriyo boruları içinde kalmış herhangi bir doku tutun. </li><li> post-sabitleme için hazır olana kadar kriyostat içinde cam plakalar üzerine bölümleri bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA içine daldırılarak kesitlere düzeltin. </li><li> Standart protokollere 8&#39;e göre boyama gerçekleştirin. </li></ol></li><li> (Spinal kord ve DRG&#39;lerde için geçerlidir) cryo kesit için sabit doku <ol><li> % 4 PFA (omurilik 2 H, fare DRG&#39;ler 1.5 saat ve sıçan DRG&#39;ler 4 saat), spinal kordon ve DRG&#39;ler saptamak4 ° C (yatay konuma omurilik bükülmüş pozisyonda sabitlenmesi önlemek için). </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece / hac sakaroz% 25 ağ doku aktarın. Doku daha sonra kullanmak kadar 4 ° C &#39;de mikrobiyal kirlenmenin önlenmesi için,% 10 sodyum azid birkaç damla ile takviye / hac sakaroz% 25 ağ saklanabilir. Gerekirse, sadece silikon tahta veya benzeri lomber genişleme telafi etmek için omurilik kırpın. </li><li> Bir kağıt havlu ucunu kullanarak, doku fazlalığı sakaroz çözeltisini aspire. </li><li> gömülü malzemenin bir cryo kalıp yarım doldurun. Böyle kapalı cımbız gibi araçlarla kriyo kalıp kenarlarına kabarcıkları itin. </li><li> cımbız kullanarak gömülü malzemenin üzerine doku yerleştirin ve istenen doku yönlendirmesini sağlamak. </li><li> Gömülü malzemenin tamamen cryo kalıp doldurun ve olduğunca uzak (kapalı cımbız kullanarak örneğin) mümkün olduğunca dokudan kabarcıkları itin. </li><li> (100 mm Petri doldurun2-metilbütan çapında) &#39;de. Bu madde zararlıdır. Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin ve kurum kurallarına göre maddeyi işlemek (DİKKAT: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Kuru buz tabakası Petri tabağına yerleştirin ve Petri kabı, iki kuru buz küpleri ekleyin. Petri kabındaki cryo kalıp yerleştirin ve gömme malzeme tamamen dondurmak için izin. </li><li> Her zaman kuru buz üzerinde gömülü doku tutun veya daha fazla işlem kadar Parafilm sarılmış -80 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> Bir kriyostat (-20 ° C) istenen kalınlık doku, örneğin, 5 um kesin. </li><li> Standart protokollere 8&#39;e göre boyama gerçekleştirin. </li></ol></li><li> (Spinal kord ve DRG&#39;lerde için geçerlidir) parafin katıştırma için sabit doku <ol><li> 4 ° C (yer omurilik% 4 PFA (omurilik için 2 saat, fare DRG&#39;lerde için 1.5 saat ve sıçan DRG&#39;lerde için 4 saat) omuriliği ve DRG&#39;ler Fixyatay konumda) bükülmüş pozisyonda sabitlenmesi engellemek için. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece / hac sakaroz% 25 ağ doku aktarın. Doku daha sonra kullanmak kadar 4 ° C &#39;de mikrobiyal kirlenmenin önlenmesi için,% 10 sodyum azid birkaç damla ile takviye / hac sakaroz% 25 ağ saklanabilir. </li><li> Omurilik lomber genişleme örneğin, ilgi doku alanını izole edin. </li><li> parafin ile gömme kalıp yarım doldurun. </li><li> hafifçe parafin sertleşmesine gömme makinenin soğutma alanında yerleştirerek gömme kalıp kısaca serinleyin. Bu iyi bir doku konumlandırma için izin verir. </li><li> gömme kalıp içinde istenilen yönde doku yerleştirin. parafin ile gömme kalıp doldurun ve hemen serin. </li><li> tamamen sertleşmeye ve gömme kalıp doku içeren parafin blok kaldırmak izin 4 ° C gece boyunca parafin içeren gömme kalıp yerleştirin. </li><li> Kes bölümler oistenilen kalınlıkta na mikrotom, örneğin 5 mikron. </li><li> Standart protokollere 8&#39;e göre boyama gerçekleştirin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Omurga servikal dislokasyon örneğin, rahatsız edilirse, omurilik ekstrüzyon sırasında bölünmüş olacaktır. spinal kord ekstrüde edilemiyorsa, omurga her iki uçta da biraz kesilmiş olabilir ve ekstrüzyon girişimi tekrarlanabilir. Durumda, tüm omurga yani servikal genişleme ve bel genişliğine oluşan daha fazla analiz için gerekli olan, omurga sadece biraz kesilmiş olmalıdır. Sadece bel genişliğine, daha fazla analiz için gerekli olan ise, omurilik, bu protokole göre kesilmiş olmalıdır. Omurga ekstrüzyon kolaylaştırmak için parmak uçlarınızı kullanarak doğruldu gerekir. Protokol her yaştan kemirgen uygulanabilir ve burada bir yetişkin fare (8 hafta), yavru bir fare (5 gün) ve bir yetişkin farenin (10 hafta) ile tarif edilmektedir. Hayvan Çeşidi ve şekil ile ilgili olarak, torasik ve lumbar bölümlerin sayısı, 9 değişebilir </sup&gt; 10, 11. protein bağlı olarak, yetişkin kemirgenler Ötenazi öncesinde enzim inhibe edici çözümler ile perfüze edilebilir, analiz edilecek. tek taraflı sinir hasarı içeren bir deney gerçekleştirmek ise, omurilik hemen ekstrüzyon sonrası ultra-ince cımbız kullanarak ipsilateral ve kontralateral tarafta ayrılabilir. Dahası, her yan dorsal ve ventral tarafı ayrılabilir. Doku daha sonra analiz, örneğin Western blot için işlenebilir. Bu, omurilik esnek olmayan hale ve omurilik hidrolik ekstrüzyonu engellemektedir Omurilik ekstrüzyon öncesinde PFA transcardial perfüzyon fikse kaçınılmalıdır. Hidrolik omurilik ekstrüzyon dorsal kökleri koparmak olacaktır. Ekli dorsal köklerin gerekli deneyler için, laminektomi tavsiye edilir. Ayrıca, omurga beyin zarı, standart laminektomi önlenebilir hidrolik ekstrüzyon ile kaybolur spinal kord ve DRG izolasyon hidrolik ekstrüzyon yerine de buz soğukluğunda PBS oksijenlenmiş yapay serebrospinal sıvı (ACSF) ile gerçekleştirilebilir. ACSF kullanımı takip eden elektrofizyolojik kayıtları 12, 13 söz konusu olduğunda özellikle önemlidir, daha iyi bir fizyolojik bir ortamda, izole dokusunun sağlar. ACSF için alternatif bir PBS, 1 g / primer DRG kültürler 14 oluşturulması için L glikoz ihtiva eden olabilir. Omuriliğin hidrolik ekstrüzyon laminektomi ile omurilik izolasyonu geleneksel şekilde, doku işleme süresini azaltan ve bu nedenle protein hasarı riskini azaltmak daha önemli ölçüde daha hızlı bir yöntemdir. bir sabitleyici ile perfüzyon önce Diseksiyon sırasında ve son çıkarılması sırasında doku hasarı riskini azaltabilir laminektomi ile omurilik izole etmekomurilikten omurilik. Ancak, doku tespit gibi Western blot olarak analizlere uygulanabilirliğini engellemektedir. Hidrolik ekstrüzyon verimi analizler daha geniş bir aralığı için uygun yapısal hasar görmemiş doku 3. DRG&#39;ler Tutarlı kimlik zor olabilir. Bununla birlikte, bu, örneğin siyatik sinir zedelenmesini takiben, doku analizi için gereklidir. costadan kendi lokalizasyon göreli göre DRG&#39;ler numaralama ile, DRG tutarlı tespit edilebilir. DRG&#39;lerin gibi omurilik dokusu boyama protokolü Adım 7&#39;de tarif gösterilen doku işlem varyasyonları gerçekleştirerek optimize edilebilir.

Bu yöntem genel amacı omurilik izole etmek için ayrıca, 2 DRG&#39;ler 1 belirlemek ve izole etmek. Omuriliğin hidrolik ekstrüzyon aynı anda spinal vertebra bir kırarak yani laminektomi ile omurilik izolasyonu, geleneksel bir şekilde daha önemli ölçüde daha hızlı bir yöntemdir ve bu yöntem diseksiyon işlemi 3, 4 yol açtığı doku hasarı riskini azaltır . DRG belirlemek zor olabilir. Doğru tanımlama, örneğin siyatik sinir yaralanmasından sonra, doku analizi için son derece önemlidir. costadan kendi lokalizasyon göreli göre DRG&#39;ler numaralama ile, DRG tutarlı tespit edilebilir. Burada gösterilen tekniklerle izole edilmiş bir doku, Western blotting 5 de dahil olmak üzere analiz, geniş bir aralığına uygulanabilmektedir6, qPCR 7 ve immünohistokimyasal 8. DRG&#39;ler belirlenmesi, omurilik segment sayısı hayvan türü ve zorlanma 9, 10, 11 ile değiştiği bilinmektedir dikkate almak önemlidir. Farelerde bu yöntemin gerçekleştirilmesi avantajları mevcut genetiği değiştirilmiş çeşitleri ve nispeten düşük konut giderlerinin yüksek sayısıdır. fareler kullanarak avantajları nispeten yüksek doku verim ve sinir yaralanmaları içeren eğer, prosedür boyutu ile hafifletti olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 14084-08</td>
			<td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5427 R</td>
			<td>For centrifugation of homogenized tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># CM 3050 S</td>
			<td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 3</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11231-30</td>
			<td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 5</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11252-20</td>
			<td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td>
			<td>Abbott</td>
			<td># 002185</td>
			<td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane GPR rectapur</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 24872.298</td>
			<td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># RM 2155</td>
			<td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 76243</td>
			<td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin tissue embedding station</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># EG1160</td>
			<td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestel, motor cordless</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># Z359971-1EA</td>
			<td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td># 121V</td>
			<td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># P7741</td>
			<td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 04906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, 1-200 &#956;l, no filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td># 70.1189.105</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Complete</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 05892791001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># R0901</td>
			<td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Protect Mini KiT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 74124</td>
			<td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td># REF0203</td>
			<td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td>
			<td>Bochem</td>
			<td># 4070</td>
			<td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, 130 mm cutting edge</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td># 1902.0130</td>
			<td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 15009-08</td>
			<td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x</td>
			<td>Leica</td>
			<td># 10446370</td>
			<td>Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td># 10010-015</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 23 G x 1&#34;, 0.6 x 25 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-2325R</td>
			<td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-1838S</td>
			<td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura</td>
			<td># 4583</td>
			<td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNE-lysis buffer</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 10128-582</td>
			<td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Hidrolik ekstrüde omurilikler, Şekil 1 &#39;de gösterilen düz bir hasarsız bir yüzey gösterir. Bel genişliğine kolaylıkla Şekil 1 &#39;de kutulu omurilik kalınlaştırılmış alanı olarak tanımlanabilir. omurilik dorsal ve ventral taraf morfolojiye göre göz ile tespit edilebilir. Şekil 1&#39;de, ventral tarafı tüm omurilik boyunca açık bir orta hat ile tanımlanabilir görüntüleyici karşı karşıyadır. omurilik boyunca iki geniş çizgiler sırt tarafında tanımlanmasını sağlar. uzak-en sonunda, KES zaman yetişkin farelerde ve yetişkin farelerde takılı kalabilir. Omurga, Şekil 2&#39;de yer alan ise bireysel DRG&#39;ler yalnızca tespit edilebilir. Izolasyon, Şekil 3 ardından, bireysel DRG görünüm tarafından tespit edilemez. Gerekirse, bu nedenle,Onları tutmak için önemlidir açıkça izolasyon üzerine ayrılmış. Aşama 7.3&#39;deki ve Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi izole edildikten sonra, omurilik ve DRG işlenir ve boyandı. Şekil 4a nöronlar ve onların çevresindeki uydu glial hücreler açıkça görülebilir bir DRG bölümünün bir immunohistokimyasal boyanma gösterir. DRG doğru tanımlanması ile o yaralı nöronun soma yanı sıra çevrelerindeki uydu glial hücreler üzerinde siyatik sinir yaralanması etkisini analiz etmek mümkündür. Şekil 4b bölümün düzgün kenarlı tarafından yansıtılan doku bozulmamış bir hidrolik presten omuriliğin bir Nissl boyamasını göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Şekil 4: Örnek doku bölümleri. Bir. DRG bölümünün immünohistokimyasal boyama. B. Nissl lekeli sectiohidrolik ekstrude omurilik n. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents at JoVE.com

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.7K Görüntüleme.  Aarhus University. Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage. 

Video: Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Dorsal Kök Potansiyel Kayıt By Farelerde Spinal Presinaptik Engellenme Ölçme<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler