1. Raccolta dei campioni

1. Raccogliere il campione di terreno e trasportare al laboratorio per l'analisi microbica.
2. In laboratorio, pesare un campione di 10 g utilizzando una bilancia analitica.
3. Diluire il campione 1:10 in 95 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (10 parti di terreno equivale a 5 parti di liquido acquoso) e vortice da miscelare(Figura 2,Fase 1).
4. Eseguire successive diluizioni 1:10 fino ad almeno 10^-5 g di terreno per mL e diluizioni selezionate a piastre di diffusione in repliche di due o tre su un mezzo agar a basso contenuto di nutrienti(ad esempio,R2A) (Figura 2, Passaggi 2-3).
5. Incubare le piastre per una settimana a temperatura ambiente (Figura 2, Passo 4).
6. Selezionare una o due colonie per l'isolamento e strisciare su piastre di agar fresche (Figura 3, Passaggi 1-3).
7. Incubare le piastre striata per due o tre giorni a temperatura ambiente (Figura 3, Fase 4).

2. Preparazione di strisci batterici

1. Osservare le piastre striate per le colonie isolate.
2. Per preparare ogni preparazione dello striscio, immergere un ciclo di inoculazione nell'etanolo, sterilizzare a fiamma e posizionare da 1 a 2 cicli di acqua distillata sterile al centro di vetrini pre-puliti.
3. Sterilizzare nuovamente il ciclo di inoculazione come descritto in precedenza. Una volta raffreddato, rimuovere una piccola quantità di coltura da una singola colonia isolata e mescolarla con le goccioline d'acqua sul vetrino (lo striscio dovrebbe assomigliare al latte scremato diluito). Il ciclo di inoculazione deve essere raffreddato prima dell'isolamento della colonia. Un ciclo troppo caldo causerà lo schizzo della colonia e / o del mezzo, che può portare all'aerosolizzazione dei batteri. Generalmente, quando il loop è troppo caldo per l'uso, si sentirà un suono "sissante" quando applicato all'agar o alla colonia. Il raffreddamento improprio del loop può anche comportare un trasferimento da coltura a diapositiva meno efficiente e una distorsione della morfologia cellulare.
4. Stendere lo striscio sulla superficie del vetrino di circa 2,5 cm x 2,5 cm e lasciarlo asciugare all'aria. È importante che l'essiccazione all'aria avvenga in condizioni di flusso laminare. Le diapositive non devono essere asciugate in modo da non interrompere lo striscio. Inoltre, i vetrini non devono essere essiccati a fiamma, al fine di mantenere la morfologia cellulare.
5. Dopo l'asciugatura, il calore fissa lo striscio facendo passare rapidamente la diapositiva attraverso una fiamma 2-3x. Il vetrino non deve essere tenuto fermo nella fiamma, per evitare distorsioni della morfologia cellulare e/o danni al vetrino.

3. Colorazione del grammo

1. Fissare la diapositiva a un'estremità usando una molletta pulita.
2. Coprire lo striscio con viola cristallo (macchia primaria) e tenere premuto per 2 o 3 minuti.
3. Lavare accuratamente lo scivolo con acqua distillata. Il flusso d'acqua non deve essere diretto verso lo striscio per evitare danni e/o distacchi dal vetrino.
4. Coprire lo striscio con lo iodio di Gram e tenere premuto per 2 minuti, quindi risciacquare delicatamente lo scivolo con acqua.
5. Decolorare lo striscio usando il 95% di etanolo fino a quando la macchia non si lava più dal vetrino (questo di solito non richiede più di 20 s a seconda dello spessore dello striscio), quindi risciacquare immediatamente con acqua distillata. Questo passaggio è fondamentale per evitare la decolorazione eccessiva della diapositiva, che può portare a una falsa designazione della macchia di Gram(cioè grammo-variabile).
6. Aggiungere la controstain (safranin) allo striscio e tenere premuto per 30 s. Quindi risciacquare delicatamente il vetrino con acqua distillata e asciugare con carta assorbente.

4. Osservazione microscopica dei vetrini

1. Osservare le diapositive utilizzando obiettivi bassi(ad esempio,4X o 10X), ad alta secchezza(ad esempio,40X) e ad immersione in olio (100X). Per l'immersione in olio, aggiungere l'olio direttamente allo striscio.
2. Per i risultati rappresentativi dei batteri del suolo Gram-positivi e Gram-negativi, vedere le figure 4 e 5.

Figura 2. Tecnica di diluizione e Spalmatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Isolamento della colonia utilizzando la tecnica streak plate.

Figura 4. Batterio del suolo Gram-positivo Staphylococcus aureus.

Figura 5. Batterio del suolo Gram-negativo Escherichia coli.