דילול סדרתי ו ציפוי: ספירה מיקרוביאלית

Overview

מקור:^ג'ונתןפ. בלייז 1 , אליזבת סוטר¹, וכריסטופר פ קורבו¹
¹ המחלקה למדעי הביולוגיה, מכללת וגנר, דרך הקמפוס 1, סטטן איילנד ניו יורק, 10301

הערכה כמותית של פרוקריוטים יכולה להיות מכבידה בהתחשב בשפע שלהם, נטייתם להתפשטות מעריכית, מגוון מינים באוכלוסייה וצרכים פיזיולוגיים ספציפיים. בנוסף לאתגר זה, הוא הטבע הארבע-פאזי שבו חיידקים משתכפלים (עיכוב, יומן, נייח ומוות). היכולת להעריך במדויק את ריכוז המיקרואורגניזם נחוצה לזיהוי מוצלח, בידוד, טיפוח ואפיון (6). ככזה, מיקרוביולוגים השתמשו בדילול סדרתי וטכניקות ציפוי שונות במשך למעלה ממאה שנה כדי לכמת באופן אמין עומס חיידקי ויראלי בסביבות מעבדה קליניות, תעשייתיות, פרמצבטיות ואקדמאיות (2,4,6). תיאורים של מתודולוגיה זו הופיעו לראשונה בשנת 1883 כאשר המדען והרופא הגרמני רוברט קוך פרסם את עבודתו על סוכנים הגורמים למחלות זיהומיות (2). הטכניקות הידועות מראש של קוך, המכונות לעתים קרובות אבי הבקטריולוגיה המודרנית, הפכו לסטנדרט הזהב לספירת מיקרואורגניזמים, הניתנים לפולחן או אחר, ברחבי העולם.

דילול סדרתי הוא הפחתה שיטתית של ישות ידועה או לא ידועה (solute, אורגניזם, וכו ') באמצעות השעיה מחדש רצופה של פתרון ראשוני (פתרון₀) לתוך נפחים קבועים של דילול נוזלי (ריק). החסרים האלה מורכבים בדרך כלל 0.45% מלוחים, אם כי הרכב יכול להיות מגוון (7). בעוד שנסיין יכול לבחור כל אמצעי אחסון עבור כל דילול, זה לרוב כפולה של 10, להקל על הפחתה לוגריתמית של המדגם. לדוגמה, פתרון₀ מכיל סך של 100 תאי E. coli מושעים ב 10 מ"ל של מרק מיזיני. אם 1 מ"ל של פתרון₀ מוסר ומתווסף 9 מ"ל של מלוחים (דילול_1),הפתרון החדש (פתרון₁₎יכיל 1/10^th של הריכוז הראשוני של E. coli. בדוגמה זו, הפתרון החדש (פתרון₁) יכיל 10 תאי E. coli. חזרה על תהליך זה על ידי הסרת 1 מ"ל של פתרון₁ והוספתו עוד 9 מ"ל של מלוחים (דילול₂) יניב פתרון₂, המכיל רק תא E. coli יחיד. מכיוון שכל פתרון חדש (9 מ"ל של דילול + 1 מ"ל של פתרון) מכיל סך של 10 מ"ל, אנו יכולים להסיק כי גורם הדילול להפחתה זו הוא 10 או שזה היה דילול סדרתי פי 10 (איור 1). מכיוון שהתחלנו רק עם 100 תאים בדוגמה זו ואנחנו מדללים בגורם של 10, רק שני שלבים נדרשים כדי להגיע לריכוז המינימלי המוחלט של תא אחד.

איור 1: דילול סדרתי של פתרון מניות. 1 מ"ל aliquot של פתרון המניה (פתרון₀) מתווסף צינור 1 אשר מכיל 9 מ"ל של 0.45% מלוחים (dilent₁); המוצר של תערובת זו הוא פתרון₁. חזור על ידי aliquoting 1 מ"ל של פתרון חדש שנוצר₁ והוספתו צינור 2. Aliquoting ו resuspension ממשיך בצורה זו עד הצינור הסופי הוא הגיע, דילול ריכוז המניה על ידי גורם של 10 כל אחד עם כל צעד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דילול סדרתי הוא הטכניקה הפשוטה ביותר להשגת ריכוזים לניהול של אורגניזם רצוי והוא משלים פסים של צלחת פטרי והתפשטות, רק שתיים מטכניקות ציפוי רבות המשמשות מיקרוביולוגים. יתרון זה של גישה זו הוא כי הנסיין יכול לקצור זנים טהורים של מין אחד או זנים נפרדים מאוכלוסייה מעורבת (7). פסים מתבצעים על ידי החדרת אורגניזם למדיום מוצק (בדרך כלל מורכב אגרוז) כי הוא יגדל על אם החומרים המזינים המתאימים זמינים. ניקוי עדין של לולאת חנק סטרילית על פני המדיום (כך שיישאר פס עדין) בתבנית סינוסואידית נוקשה, תפיץ את האורגניזם באופן פרופורציונלי לתדירות צורת הגל של הנסיין. חלוקת צלחת הפטרי לשליש או לרבעים (רצף רבעים) והפחתת התדירות של כל פס כאזור חדש של המנה נכנס בהדרגה להפחית את מספר מיקרואורגניזמים שיכולים לכבוש את האזור הזה, לייצר מושבות בודדות במקום דשא חיידקי בלתי ניתן לערעור. ציפוי ממרח אינו מדלל בנוסף דגימות; מפיץ זכוכית סטרילי משמש להפצת עליקוט של מדיית השעיה על פני צלחת פטרי שלמה(איור 2). המושבות הגדלות על צלחת ההתפשטות נובעות מתא יחיד וניתן לספור כל מושבה בצלחת כדי להעריך את מספר היחידות היוצרות מושבה למיליליטר (CFU) בהשעיה נתונה, המיוצגת כ- CFU / mL (6) (איור 3) אגר רך וציפוי משוכפל הם וריאציות של הטכניקות הנ"ל ומאפשרים בידוד של בקטריופאז 'והקרנה מוטנטית, בהתאמה (1,7).

איור 2: צלחת פסים לספירת חיידקים ובידוד מתחים. סמן את תחתית צלחת הפטרי עם פרטי זיהוי (שם חיידק, תאריך, מדיה) וחלק לשליש. לאחר בחירת דילול מתאים של מדגם המלאי, לקחת לולאת חנק סטרילית (חד פעמית או להבה) ולהטביע אותו במבחנה (כאן, T3). להעלות מעט את כיסוי צלחת פטרי בצד אחד, כך רק לולאה מכחיק יכול לגשת אגר. גלה את הלולאה המחוסנת על פני החלק העליון של התקשורת בצורה זיג-זג נזהר לא להתפשר על אגר. סובב את הלוח בערך פי^1/3 (~ 118°) והפחית את תדירות תנועת זיג-זג. סובב בפעם האחרונה והפחת את תדירות הזיג-זג פעם נוספת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: למרוח ציפוי. גרם אחד של האזור האירובי היה תוחם מחדש ב- T1 ולאחר מכן מדולל באופן סדרתי. זכוכית סטרילית או מוט מתפשט חד פעמי פלסטיק משמש להפצת אינוקולום בכל מנה. זה חזר על עצמו עם 1 גרם של האזור אנאירובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כמו בדילול סדרתי, קנה מידה לוגריתמי משמש כדי לבטא ריכוז אורגניזמי. ניתן למנות ידנית את מספר המושבות הגדלות בצלחות פטרי סטנדרטיות בגודל 100 מ"מ x15 מ"מ (או אוטומטיות בעזרת עיבוד חישובי) על ידי זיהוי אשכולות מבודדים של צמיחה. ספירות הכוללות פחות מ- 30 או יותר מ- 300 צריכות להיות מוגדרות כמעטות מכדי לספור (TFTC) או רבות מכדי לספור (TNTC), בהתאמה. במקרה של האחרון, דילול סדרתי צריך להתבצע כדי להפחית את הריכוז לפני restreaking צלחת פטרי חדשה. ממוצע מספר המושבות העצמאות שזוהו משלוש מנות פטרי נפרדות והכפלת הממוצע על ידי גורם הדילול יניבו CFU / mL; התוויית_{יומן 10} של CFU / mL נגד הזמן תחשוף את זמן הדור הממוצע של האורגניזם (7).

Procedure

1. הגדרת

תרשים זרימה המפרט את כל החומרים, פרוטוקול ניסיוני צעד ושיטה למחיקת חומרים מתכלים צריכים להיכתב במחברת מעבדה ושמר ליד סביבת העבודה הניסיונית.
יש לעקר סביבות עבודה עם חומר חיטוי מתאים (70% אתנול) ועל הנסיין למתן את סכנת הזיהום על ידי לבישת בגדי מעבדה נקיים המגינים עליהם גם מפני אנומליות חשיפה. בגדים מתאימים כוללים אך אינם מוגבלים לחלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל, גוגל, מכונות הנשמה ונעליים סגורות. זה קריטי כדי לשמור על טכניקה אספטית בכל עת.
הכן 90 מ"ל של 0.45% מלוחים. באמצעות גליל בוגר נקי, למדוד 90 מ"ל של מים סטריליים ולהעביר אותו בקבוקון Erlenmeyer נקי שכותרתו 0.45% מלוחים. שקלו 0.405 גרם נתרן כלורי (סיגמא-אולדריץ' NaCl S9888) והוסיפו אותו לבקבוקון שכותרתו 0.45% מלוחים. מערבבים שוב ושוב עד שאף מבול לא נשאר גלוי.
עם השלמת, הנסיין צריך לעקר מחדש את כל המשטחים ולהשליך כל אורגניזמים לא רצויים, מלאי דילול, צלחות פטרי, או לולאות חנק חד פעמיות על פי הנחיות OSHA. ניתן להסיר בגדי מעבדה לפני שטיפת ידיים.

2. הכנה לתקשורת

בחר מדיה המתאימה לטיפוח אורגניזם רצוי. ברוב התרחישים, מרק יאפשר צמיחה חיידקית מספקת. מאז אורגניזמים מפרוטוקול וינוגרדסקי רצויים כאן, טור המורכב סידן פחמתי, גופרית, תאית ובוץ הורכב ונשאר ללא הפרעה במשך 7 ימים. הטור המופרד לחלקים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים.
בחר מדיום המתאים ל ציפוי האורגניזם של עניין. תוספי של מדיה נוזלית עם אגר כיתה מיקרוביולוגיה מועסק בדרך כלל כסוכן מתגבש. LB בינוני / אגר מספיק בעת קצירת דגימות מאזורים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים של הטור forenamed. הערה: דגימות מהאזור המיקרואורופילי לא נקצרים עבור הליך זה. עם זאת, אורגניזמים אלה צריכים להיות מעובדים בצנצנות נרות. החדרת נר לתא הטיפוח הזה לפני האיטום יוצרת סביבת חמצן נמוכה המתאימה להתפשטות מיקרואורופילית.
מאז אנחנו רוצים להכין 250 מ"ל, להשתמש 500 מ"ל (או גדול יותר) צלוחיות Erlenmeyer כדי למנוע boil-over בעת autoclaving. תייג אחד "מרק" והשני "אגר".
קבע את כמות המדיה הדרושה ליצירת כל פתרון על-ידי ביצוע המלצות הריכוז של היצרן. LB אגר, המשמש כאן, מוכן על ידי שילוב 25 גרם / L עם מים אולטרה pure. נפח של 250 מ"ל שלנו דורש פתרון של 6.25 LB אגר / 250 מ"ל מים. באופן דומה, מרק LB מוכן על ידי שילוב אותו יחס של מרק LB ומים. מאז זה לא בתוספת עם סוכן מתגבש, זה לא להקשיח כאשר מקורר.
שקול את המדיה ומערבב אותה עם מים בפרופורציות העולות בקנה אחד עם המלצות היצרן. הוסף 6.25 גרם של LB אגר לבקבוקון שכותרתו "אגר", ו 6.25 גרם של מרק LB לבקבוקון שכותרתו "מרק". מוסיפים 250 מ"ל מים אולטרה-תפותיים לכל בקבוקון.
עטפו רדיד אלומיניום על כל בקבוקון והשתמשו ב-autoclave כדי לעקר את המדיה למשך 15 דקות לפחות ב-121 מעלות צלזיוס, 15 פסאיי.
באמצעות כפפה או כרית עמידים בחום, להסיר את הבקבוקונים מן autoclave עם השלמת המחזור ומניחים אותם באמבט מים 40-50 מעלות צלזיוס.
לאחר הטמפרטורה המתאימה כבר הגיע, לשפוך את התוכן של הבקבוקון שכותרתו "מרק" לתוך 250 מ"ל Erlenmeyer, או בקבוקון עגול התחתון. תייג את הבקבוקון 250 מ"ל "פתרון_0".
להשיג 10, 100mm x 15 מ"מ צלחות פטרי סטריליות ולתייג אותם עם התאריך, שם, סוג המדיה בשימוש ואת אזור העמודה Winogradsky כי אורגניזמים ייקצרו.
מוציאים את הבקבוקון שכותרתו "אגר" מאמבט המים ומתחילים לשפוך לתוך כל אחת מעשר מנות הפטרי. לא יותר מ 15 מ"ל יש להוסיף לכל מנה. זה יכול להתבצע גם עם pipettor ו 25 מ"ל סרולוגי pipette כדי לשפר את הדיוק. השתמש קצה pipette סטרילי כדי להסיר את כל הבועות הקיימות, ולאחר מכן לכסות עם מכסי הצלחת ולהשאיר להתמצק לילה.

3. הכנה מדוללת

הכן עשר מבחנה המסוגלות לאחסן 20 מ"ל או יותר בארון תקשורת ולתייג אותן T1-T10. כל מספר צינור עולה בקנה אחד עם גורם הדילול אליו הוא מתאים (כלומר, T4 = 1x10^-4 או 0.0001 או 1/10,000th של ריכוז מלאי).
צינור 9 מ"ל של 0.45% מלוחים לתוך כל אחת מ -10 המבחנות.
כדורי סרק מלוחים מוכנים כעת לעוקר על ידי autoclave. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות כל אחת מ -10 המבחנות ולאחר מכן העבר אותן למתלה מבחנה תואם אוטומטית. לחטא במשך מינימום של 15 דקות ב 121°C, 15 פסאיי.
הסר ריק באמצעות כפפות עמידות בחום ולאפשר להתקרר. לכסות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך כאשר הצינורות הגיעו לטמפרטורת החדר, או כאשר קריר למגע.

4. טיפוח אורגניזם היעד

לחסן " פתרון₀" עם מושבה אחת מצלחת מפוספסת בעבר או 50 μL של מלאי קפוא. אפשר זמן האורגניזם היעד לשכפל על ידי הצבת " פתרון₀" מחוסן לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד (במידת הצורך). (הערה: הבקבוקון צריך להיות מכוסה כדי למנוע זיהום. אם האורגניזם היעד הוא אירובי, השתמש גזה סטרילית ותקעים כותנה כדי למנוע זיהום. אם בוחנים אזורים בעמודה של וינוגרדסקי, פשוט הסירו גרם אחד מכל אזור רצוי (אירובי ואנאירובי למטרות מחקר זה) והיתכנו מחדש ב- T1 לפני שתמשיכו לשלב 5.3.

5. דילול סדרתי

להשיג את הבקבוקון שכותרתו "מרק מיזים" מן האינקובטור ולנער במרץ.
Pipet 1 מ"ל של " פתרון₀" לתוך המבחנה שכותרתו T1. מערבולת T1. אם בוחנים את Explants ווינגרדסקי, שקול 1 גרם של האזור הרצוי ולהוסיף אותו T1 לפני מערבולת. (הערה: 1 מ"ל משמש כאן לפשטות - ניתן להשתמש גם בנפחים קטנים יותר או גדולים יותר של דילול).
הסר 1 מ"ל מבחנה T1 ולהוסיף אותו מבחנה T2. מערבולת T2.
הסר 1 מ"ל מבחנה T2 ולהוסיף אותו במבחנה T3. מערבולת T3.
הסר 1 מ"ל מבחנה T3 ולהוסיף אותו במבחנה T4. מערבולת טי-4.
הסר 1 מ"ל מבחנה T4 ולהוסיף אותו במבחנה T5. מערבולת T5.
הסר 1 מ"ל מבחנה T5 ולהוסיף אותו מבחנה T6. מערבולת T6.
הסר 1 מ"ל מבחנה T6 ולהוסיף אותו במבחנה T7. מערבולת T7.
הסר 1 מ"ל מבחנה T7 ולהוסיף אותו מבחנה T8. מערבולת T8.
הסר 1 מ"ל מבחנה T8 ולהוסיף אותו במבחנה T9. מערבולת טי-9.
הסר 1 מ"ל מבחנה T9 ולהוסיף אותו במבחנה T10.

6. ציפוי התפשטות

Pipet 100 μL של מדגם מדולל מ T1 ישירות על צלחת פטרי. שלב זה יכול להיות, אבל לא צריך להיות, חוזר על עצמו עבור כל צינור.
יש להשיג מוט מתפשט סטרילי וחד פעמי או להבה לחטא מוט התפשטות זכוכית. בתנועה בכיוון השעון/נגד כיוון השעון, החלק האופקי של מוט ההתפשטות כדי לחלק את המדגם באותה מידה בתוך צלחת הפטרי.
חזור על הפעולה עבור כל אזור בעמודה Winogradsky שיש להעריך.
לוחות דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אנאירובי.

7. פסים

בחר דילול מתאים של אורגניזם היעד שלך. לדוגמה, פתרון₄ יניב דילול של 1/10,000 של הריכוז הראשוני שלך. בדרך כלל, דילול של 1/1,000^th (T3/Solution), 1/1,000,000^th (T6/Solution₆₎ו-1/1,000,000,000^th (T9/Solution₉) מוערכים כדי למנות חיידקים.
באמצעות לולאת חנק חד פעמית סטרילית מפלסטיק או לולאת חנק מתכת לשימוש חוזר שהייתה תחת אש במשך לא פחות מ -10 שניות, לטבול את הפתרון הרצוי מהשלב 5. לולאות חקינה מכוילות אמורות להעביר 0.01 מ"ל. (אזהרה: אין לאפשר לולאה להבה ליצור קשר עם חיידקים מיד לאחר הסרת מהחום)
להעלות מעט את כיסוי צלחת פטרי בצד אחד, כך רק לולאה מכחיק יכול לגשת אגר. גלה את הלולאה המחוסנת על פני החלק העליון של התקשורת בצורה זיג-זג נזהר לא להתפשר על אגר. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
השתמש בלולאת פיקוח חד פעמית חדשה או עיקור מחדש של הלולאה הניתן לשימוש חוזר.
סובב את הלוח בערך פי^1/3 (~ 118°) והפחית את תדירות תנועת זיג-זג.
שוב, השתמש בלולאה חד פעמית חדשה או עקר מחדש לולאת מתכת לפני סיבוב בפעם האחרונה והפחית את תדר הזיג-זג פעם נוספת. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.
חזור על שלבים 7.2 - 7.6 עד שלפחות שלוש מנות פטרי פוספסו במשך שלושה דילולים שונים, באמצעות לולאה חד פעמית חדשה או על ידי הלולאה לשימוש חוזר(איור 2).
הניחו בין לילה מנות פטרי מפוספסות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אירובי.

8. ניתוח נתונים ותוצאות

תרבויות נקצרו מהאזורים האוקסיים והאנוקסיים של טור וינוגרדסקי בן 7 ימים. אזורים אלה מתאימים לאנרובים הטרוטרופיים ומחמצן ברזל, בהתאמה.
מסלקי העמודים היו מדוללים באופן סדרתי לפני פסים או התפשטות על לוחות אגר LB.
פסים חשפו אוכלוסייה מעורבת מכל אחד מאזורי וינוגרדסקי שהוערכו. לוחות התפשטות הניבו תוצאות דומות.
כדי לחשב CFU/mL או CFU/g, ממוצע מספר המושבות שנספרו משלוש לוחות. הכפל את המספר הממוצע של מושבות על ידי גורם הדילול ולחלק בסכום aliquoted. לדוגמה, אם נספרו בממוצע 65 מושבות על לוחות שחוסנו עם 0.1 מ"ל של פתרון₆ (T6) הנוסחה שתוארה בעבר תהיה שווה ל- 650,000,000 יחידות רה-תכליתיות /mL.
כעת ניתן לבחור מושבות מבודדות מכל צלחת לשימוש בבדיקות העשרה כדי לקבוע את זהות המינים.

Application and Summary

הספירה החיידקית ובידוד המתח על ידי ציפוי דורש ריכוזים לניהול של אורגניזמים היעד. ציפוי מוצלח מותנה אפוא בדילול סדרתי. ככזה, הטכניקות הנ"ל נשארות אבן הפינה של בדיקה מיקרוביולוגית וניסויים. למרות פשוט על ידי עיצוב, גורמי דילול וטכניקת ציפוי ניתן לשנות על ידי הנסיין כדי לחזק את התוצאות מבלי להתפשר על השלמות של כל שיטה. התוויית ארבעת השלבים של צמיחת חיידקים יכולה להיות מועילה בעת אפיון החיידקים הרצויים. שלבים אלה, עיכוב, יומן, נייח ומוות, מסומנים על ידי שינויים בשכפול חיידקים. שלב ההשהיה כולל צמיחה איטית עקב הסתגלות פיזיולוגית, שלב היומן הוא התקופה של התפשטות מקסימלית הכוללת עלייה מעריכית בתאים בני קיימא, שלב נייח מגיע לאחר מכן בשל מגבלות סביבתיות והצטברויות של רעלים, לפני שלב המוות שבו ספירת התאים מתחילה ליפול. זה יכול להתבצע על ידי דילול סדרתי (או דילול שלב אחד כדי למנוע בלבול) פתרון₀ כל שעה במשך סך של 8 שעות, החל בזמן₀ (פתרון₀ צריך להיות מוחזר אינקובטור רועד לאחר כל דילול). חשב את יומן הרישום₁₀ של CFU/ml עבור דילול יחיד של זמן₀ והתוויה בציר ה- Y. חזור על חישוב זה עבור זמן_{הדגימה 1} (הקפד לחשב CFU / mL באמצעות אותו גורם דילול כמו זמן₀). חזור על הפעולה עד בכל פעם (זמן₁-Time₈) יתווו על ציר ה- X.

References

Allen, M.E., Gyure, R.A. (2013) An Undergraduate Laboratory Activity Demonstrating Bacteriophage Specificity. Journal of Microbial Biological Education 14: 84-92.
Ben-David, A., Davidson, C.E. (2014) Estimation Method for Serial Dilution Experiments. Journal of Microbiological Methods 107:214-221.
Goldman, E., Green, L.H. (2008) Practical Handbook of Microbiology.
Koch, R. (1883) New Research Methods for Detection of Microcosms in Soil, Air and Water.
Lederberg, J., Lederberg, E.M. (1952) Replica Plating and Indirect Selection of Bacterial Mutants. Journal of Bacteriology 63:399-406
Pepper, I., Gerba, C., Ikner, L. (2019) Bacterial Growth Curve Analysis and its Environmental Changes. JoVE Science Education Database. Environmental Microbiology.
Sanders., E.R. (2012) Aseptic Laboratory Technique: Plating Methods. JoVE 63:e3063.