비디오: Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

연속 희석 및 플레이팅: 미생물 나열

Overview

출처: 조나단 F. 블레이즈^1,엘리자베스 수터^1,크리스토퍼 P. 코르보¹
¹ 생물과학부, 바그너 칼리지, 1 캠퍼스 로드, 스태튼 아일랜드 뉴욕, 10301

원생동물의 정량적 평가는 그들의 풍부함, 기하급수적 증식을 위한 성향, 인구 내의 종 다양성 및 특정 생리적 필요를 감안할 때 번거로울 수 있습니다. 이 도전을 복합하는 것은 박테리아가 복제하는 4 상 성질입니다 (지연, 로그, 고정 및 죽음). 미생물 농도를 정확하게 추정하는 능력은 성공적인 식별, 격리, 재배 및 특성화(6)에 필요합니다. 이와 같이, 미생물학자는 임상, 산업, 제약 및 학술 실험실 환경 (2,4,6)에서 세균및 바이러스 부하를 안정적으로 정량화하기 위해 100 년 이상 직렬 희석 및 다양한 도금 기술을 사용했습니다. 이 방법론의 설명은 독일 과학자이자 의사인 로버트 코흐(Robert Koch)가 전염병 유발 요원(2)에 대한 그의 작품을 발표했을 때 1883년에 처음 나타났습니다. 종종 현대 세균학의 아버지로 불리는 코흐의 외명 기술은 전 세계적으로 미생물을 열거하는 금본위제가 되었습니다.

직렬 희석은 초기 용액(솔루션_0)을액체 희석제(blank)의 고정 부수로 연속적으로 재정지하여 공지또는 알려지지 않은 실체(solute, 유기체 등)를 체계적으로 감소시다. 이러한 공백은 일반적으로 0.45% 식염수로 구성되지만 조성물은 다를 수 있습니다(7). 실험자는 각 희석제에 대해 임의의 부피를 선택할 수 있지만, 가장 자주 는 10의 배수이며, 샘플의 로그산염 감소를 용이하게 한다. 예를 들어, 용액_0은 영양국물의 10mL에 매달린 총 100개의 대장균 세포를 함유하고 있다. 용액_0의 1mL이 제거되고 식염수(희석_1)의9mL에 추가되면, 새로운 용액(1)은 대장균의초기 농도의 1/10^th를 포함하게 된다. 이 예에서, 새로운 용액(솔루션_1)에는10개의 대장균 세포가 포함됩니다. 이 과정을 반복하여 1mL의 용액_1을 제거하고 또 다른 9mL의 식염수(희석2)에 첨가함으로써 단일 대장균 세포만 을 포함하는 용액_2를산출한다. 각각의 새로운 솔루션(희석제 + 1mL의 용액)은 총 10mL를 포함하고 있기 때문에, 이러한 감소에 대한 희석계수가 10배이거나 10배 의 일련 희석(그림1)이라고결론을 내릴 수 있다. 우리는 이 예에서 100개의 세포로 만 시작하고 10의 요인에 의해 희석하고 있기 때문에, 단지 2단계는 1 세포의 절대 최소 농도에 도달하기 위하여 요구됩니다.

그림 1: 주식 솔루션의 직렬 희석. 스톡 용액의 1mL 알리쿼트(솔루션_0)는0.45% 식염수(dilent_1)의9mL를 포함하는 튜브 1에 첨가된다. 이 혼합물의 제품은 용액_1입니다. 새로 만든 솔루션_1의 1mL를 알리쿼팅하고 튜브 2에 추가하여 반복합니다. 알리쿼팅 및 재서스펜션은 최종 튜브에 도달할 때까지 이러한 방식으로 계속되며, 각 단계마다 10배씩 재고 농도를 희석시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

직렬 희석은 원하는 유기체의 관리 가능한 농도를 얻기위한 가장 간단한 기술이며, 미생물학자가 사용하는 많은 도금 기술의 두 개, 페트리 접시 줄무늬 및 확산에 의해 보완된다. 이 접근법의 이점은 실험자가 단일 종의 순수한 균주를 수확하거나 혼합 된 인구 (7)로부터 균주를 분리 할 수 있다는 것입니다. 줄무늬는 적절한 영양소를 사용할 수 있는 경우 성장하게 될 고체 배지(일반적으로 아가로즈로 구성된)에 유기체를 도입함으로써 달성된다. 단단한 부비동성 패턴에서 멸균 접종 루프를 매체를 가로질러 부드럽게 쓸어 넘기면 실험자의 파형의 주파수에 비례하여 유기체를 분배합니다. 페트리 접시를 3/4(사분면 줄무늬)로 나누고, 접시의 새로운 영역이 입력됨에 따라 각 줄무늬의 빈도를 줄이면 점차 해당 지역을 점유할 수 있는 미생물의 수가 줄어들어 정량화할 수 없는 세균 잔디 대신 단일 식민지를 생성합니다. 스프레드 도금은 시료를 추가로 희석시키지 않습니다. 멸균 유리 스프레더는 전체 페트리접시(그림 2)에서스펜션 미디어의 알리쿼트를 분배하는 데 사용됩니다. 배기판상에서 자라는 콜로니는 단일 세포에서 발생하며 각 식민지는 주어진 현탁액에서 밀리리터당 콜로니 형성 유닛(CFU)의 수를 추정할 수 있으며, CFU/mL(6)(그림3) (그림 3)소프트 한천 및 복제도금은 전술한 기술의 변형이며 박터피오파지 및 돌연변이제(7)의 분리를 허용한다.

그림 2: 세균 열거 및 균주 격리를 위한 판 줄무늬. 페트리 접시의 바닥에 식별 정보(박테리아 이름, 날짜, 미디어)로 레이블을 지정하고 3분의 1로 나눕니다. 스톡 샘플의 적절한 희석을 선택한 후 멸균(일회용 또는 화염) 접종 루프를 취하고 테스트 튜브(here, T3)를 침수합니다. 한쪽에 페트리 접시 커버를 약간 올려 서 접종 루프만 한천에 접근할 수 있습니다. 지그재그 방식으로 미디어 상단을 가로질러 접종루프를 미끄러지듯 미끄러지며 한천을 손상시키지 않도록 주의하세요. 플레이트를 약 1/3rd(~118°)로 회전시키고 지그재그 동작의 빈도를 줄입니다. 마지막 시간을 회전하고 지그재그 주파수를 한 번 더 줄입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 확산 도금. 에어로빅 영역의 1 g는 T1에서 다시 중단된 다음 직렬로 희석되었습니다. 멸균 유리 또는 플라스틱 일회용 확산 막대는 각 접시에 걸쳐 접종을 분배하는 데 사용됩니다. 이것은 혐기성 영역의 1 g로 반복되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

직렬 희석과 마찬가지로, 로그와리믹 스케일은 유기체 농도를 표현하기 위해 사용된다. 100mm x15mm를 측정하는 표준 페트리 접시에서 재배되는 콜로니의 수는 분리된 성장 클러스터를 식별하여 수동으로 열거(또는 전산 처리의 도움으로 자동화)할 수 있습니다. 30개 미만이거나 300보다 작은 합계는 계산하기에는 너무 적거나 계산할 수 없는 수(TNTC)로 정의되어야 합니다. 후자의 경우, 새로운 페트리 접시를 다시 휘감기 전에 농도를 줄이기 위해 직렬 희석을 수행해야합니다. 세 개의 분리된 페트리 접시에서 확인된 자급자족 식민지의 수를 평균화하고 희석 계수에 의해 평균을 곱하면 CFU/mL이 생성됩니다. 시간에 대한 CFU/mL의 로그_10을 플로팅하면 유기체의 평균 생성 시간이 드러나게 된다(7).

Procedure

1. 셋업

모든 재질을 나열하는 플로우 차트, 단계별 실험 프로토콜 및 소모품을 폐기하는 방법은 실험실 노트북에 작성하고 실험 작업 공간 근처에 보관해야 합니다.
작업 공간은 적절한 방부제 (70 % 에탄올)로 살균되어야하며 실험자는 노출 이상으로부터 보호하는 깨끗한 실험실 의류를 착용하여 오염 위험을 완화해야합니다. 적합한 의류에는 실험실 코트, 라텍스 또는 니트릴 장갑, 구글, 호흡보호구 및 폐쇄 신발이 포함되나 이에 국한되지 않습니다. 항상 무균 기술을 유지하는 것이 중요합니다.
식염수 0.45%의 90mL를 준비합니다. 깨끗한 졸업 실린더를 사용하여 멸균 수의 90mL를 측정하고 0.45 %의 식염수로표시된 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크로 전송합니다. 무게 .405 g의 염화 나트륨 (시그마 알드리치 NaCl S9888) 라벨 플라스크에 추가 0.45% 식염수. 솔루트가 보이지 않게 될 때까지 반복적으로 소용돌이치는 다.
완료되면 실험자는 모든 표면을 다시 살균하고 OSHA 지침에 따라 원치 않는 유기체, 희석제, 페트리 접시 또는 일회용 접종 루프를 폐기해야 합니다. 실험실 의류는 손을 씻기 전에 제거 할 수 있습니다.

2. 미디어 준비

원하는 유기체의 재배에 적합한 미디어를 선택합니다. 대부분의 시나리오에서 국물은 충분한 세균 성장을 가능하게 합니다. 위노그라드스키 프로토콜의 유기체가 여기에서 원하기 때문에 탄산칼슘, 황, 셀룰로오스 및 진흙으로 구성된 컬럼이 조립되어 7일 동안 방해받지 않고 방치되었습니다. 명명된 컬럼은 호기성, 소음조및 혐기성 섹션으로 구분됩니다.
관심 있는 유기체를 도금하는 데 적합한 매체를 선택합니다. 미생물학 등급 의 한천을 사용한 액체 매체의 보충은 일반적으로 응고제로 사용됩니다. LB 배지/한천은 외명한 컬럼의 호기성, 미세 열병및 혐기성 부위로부터 샘플을 수확할 때 충분합니다. 참고: 마이크로에어로필릭 부위의 샘플은 이 절차를 위해 수확되지 않았습니다. 그러나, 이러한 유기체는 촛불 항아리에서 재배되어야한다. 밀봉하기 전에이 재배 챔버에 촛불을 도입하면 미세 에어로포릭 증식에 적합한 낮은 산소 환경을 만듭니다.
250mL를 준비하고 자하기 때문에 500mL(또는 그 이상) Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 오토클레이브 시 종기를 방지하십시오. "국물"과 다른 하나는 "Agar"라고 레이블을 지정합니다.
제조업체 농도 권장 사항을 따라 각 솔루션을 만드는 데 필요한 미디어 양을 결정합니다. 여기에서 사용되는 LB Agar는 25g/L과 초순수를 결합하여 제조합니다. 250mL의 부피는 6.25 LB Agar/250 mL 물의 용액이 필요합니다. 마찬가지로, LB 국물은 LB 국물과 물의 동일한 비율을 결합하여 제조된다. 고화제로 보충되지 않기 때문에 냉각시 굳어지지 않습니다.
미디어를 계량하고 제조업체 권장 사항과 일치하는 비율로 물과 혼합합니다. "Agar"라고 표시된 플라스크에 6.25g의 LB 아가를 추가하고 6.25g의 LB 국물을 "국물"이라고 표시된 플라스크에 추가합니다. 각 플라스크에 250mL 초순수를 추가합니다.
각 플라스크 위에 알루미늄 호일을 감싸고 오토클레이브를 사용하여 121°C, 15psi에서 최소 15분 동안 미디어를 살균합니다.
내열 장갑이나 패드를 사용하여 사이클이 완료되면 오토클레이브에서 플라스크를 제거하고 40-50°C 수조에 넣습니다.
적절한 온도에 도달하면 "국물"이라고 표시된 플라스크의 내용을 250mL Erlenmeyer 또는 라운드 하단 플라스크에 붓습니다. 250 mL 플라스크 "솔루션_0"에레이블을 지정합니다.
10, 100mm x 15mm 멸균 페트리 접시를 얻고 날짜, 이름, 사용되는 미디어의 종류 및 유기체가 수확될 위노그라드스키 기둥 영역으로 라벨을 붙입니다.
수조에서 "Agar"라고 표시된 플라스크를 제거하고 10개의 페트리 요리에 붓기 시작합니다. 각 접시에 15mL 이상을 추가해서는 안 됩니다. 이는 또한 정확도를 높이기 위해 피페터 및 25mL 세로지컬 파이펫으로 수행될 수 있다. 멸균 파이펫 팁을 사용하여 존재하는 거품을 제거한 다음 플레이트 뚜껑으로 덮고 밤새 고형화하십시오.

3. 희석 제고

랙에 20mL 이상을 저장할 수 있는 10개의 테스트 튜브를 준비하고 T1-T10에 라벨을 부착합니다. 각 튜브 수는 희석 계수와 일치한다(즉, T4 = 1x10^-4 또는 0.0001 또는 1/10,000번째 재고 농도)에 해당한다.
파이프 9 mL의 0.45% 식염수 각각에 10 개의 시험 관.
식염수 블랭크는 이제 오토클레이브에 의해 멸균될 준비가 되었습니다. 알루미늄 호일을 사용하여 10개의 테스트 튜브를 각각 덮은 다음 오토클레이브 호환 테스트 튜브 랙으로 옮기습니다. 121°C, 15 psi에서 최소 15분 동안 멸균하십시오.
내열 장갑을 사용하여 블랭크를 제거하고 식힙니다. 튜브가 실온에 도달하거나 터치를 식힐 때 필요할 때까지 4 °C에서 덮고 보관하십시오.

4. 대상 유기체 의 재배

이전에 줄무늬 플레이트또는 냉동 재고의 50 μL에서 단일 콜로니와 "용액_0"을접종합니다. 접종된 "용액_0"을흔들림(필요한 경우)으로 밤새 37°C 인큐베이터에 배치하여 대상 유기체 시간을 복제할 수 있습니다. (참고: 플라스크는 오염을 방지하기 위해 덮여 있어야 합니다. 대상 유기체가 에어로빅인 경우 멸균 거즈와 면 플러그를 사용하여 오염을 방지하십시오. 위노그라드스키 컬럼의 영역을 평가하는 경우 원하는 각 영역(이 연구의 목적을 위해 에어로빅 및 혐기성)에서 1그램을 제거하고 5.3단계로 진행하기 전에 T1에서 다시 중단하십시오.

5. 직렬 희석

인큐베이터에서 "영양 국물"이라고 표시된 플라스크를 얻고 힘차게 흔들어 줍니다.
"용액_0"의파이프 1 mL은 T1라벨이 있는 시험관으로 들어갔다. 소용돌이 T1. 위노그라드스키를 평가하는 경우 원하는 영역의 1그램의 무게를 측정하고 소용돌이전에 T1에 추가합니다. (참고: 1 mL은 단순성으로 사용되며, 희석제의 더 작거나 더 큰 볼륨도 사용될 수 있습니다).
테스트 튜브 T1에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T2에 추가합니다. 소용돌이 T2.
테스트 튜브 T2에서 1mL를 제거하고 테스트 튜브 T3에 추가합니다. 소용돌이 T3.
테스트 튜브 T3에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T4에 추가합니다. 소용돌이 T4.
테스트 튜브 T4에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T5에 추가합니다. 소용돌이 T5.
테스트 튜브 T5에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T6에 추가합니다. 소용돌이 T6.
테스트 튜브 T6에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T7에 추가합니다. 소용돌이 T7.
테스트 튜브 T7에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T8에 추가합니다. 소용돌이 T8.
테스트 튜브 T8에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T9에 추가합니다. 소용돌이 T9.
테스트 튜브 T9에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T10에 추가합니다.

6. 스프레드 도금

T1에서 희석된 시료의 파이프 100 μL을 페트리 접시에 직접 스페트합니다. 이 단계는 각 튜브에 대해 반복될 필요는 없지만, 반복될 필요는 없습니다.
멸균, 일회용 확산 막대 또는 화염을 얻어서 유리 확산 막대를 살균합니다. 시계 방향/시계 반대 방향으로 동작하면 퍼지는 막대의 수평 부분을 미끄러져 페트리 접시 내에서 샘플을 동등하게 분배합니다.
평가할 위노그라드스키 열의 각 영역에 대해 반복합니다.
플레이트를 37°C 인큐베이터에 24시간 동안 배양합니다. 혐기성 유기체의 경우 혐기성 챔버를 사용하십시오.

7. 줄무늬

대상 유기체의 적절한 희석을 선택합니다. 예를 들어, 솔루션_4는 초기 농도의 1/10,000 희석을 산출합니다. 전형적으로, 1/1,000th(T3/솔루션), 1/1,000,000th(T6/솔루션₆₎및 1/1,000,000,000th(T9/솔루션 _9)의희석을 통해 미생물을 예중화하도록 평가된다.
플라스틱 멸균 일회용 접종 루프 또는 10초 이상 불에 불이 붙은 재사용 가능한 금속 접종 루프를 사용하여 5단계에서 원하는 용액에 담가 두세요. 보정된 접종 루프는 0.01 mL를 전송해야 합니다. (주의: 화염 루프가 열에서 제거한 직후 박테리아에 연락하는 것을 허용하지 마십시오)
한쪽에 페트리 접시 커버를 약간 올려 서 접종 루프만 한천에 접근할 수 있습니다. 지그재그 방식으로 미디어 상단을 가로질러 접종루프를 미끄러지듯 미끄러지며 한천을 손상시키지 않도록 주의하세요. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
새로운 일회용 접종 루프를 사용하거나 재사용 가능한 루프를 다시 소독하십시오.
플레이트를 약 1/3rd(~118°)로 회전시키고 지그재그 동작의 빈도를 줄입니다.
다시 말하지만, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 최종 시간을 회전하기 전에 금속 루프를 다시 살균하고 지그재그 주파수를 다시 한 번 줄입니다. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
7.2 - 7.6을 반복하여 3개의 다른 희석을 위해 적어도 3개의 페트리 요리가 줄지어 서 있거나, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 재사용 가능한루프(그림 2)를다시 불태울 때까지 반복한다.
줄무늬 페트리 요리를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다. 혐기성 유기체의 경우, 항예실 챔버를 사용합니다.

8. 데이터 분석 및 결과

배양은 7일 위노그라드스키 기둥의 소산화 및 무산소 영역에서 수확되었다. 이 구역은 각각 이종국 및 철 산화 혐기성에 적합합니다.
컬럼 이출은 LB Agar 플레이트에 줄무늬 또는 확산되기 전에 연속적으로 희석되었습니다.
줄무늬는 평가 된 위노 그라드 스키 지역의 각에서 혼합 인구를 공개했다. 스프레드 플레이트는 비슷한 결과를 낳았습니다.
CFU/mL 또는 CFU/g를 계산하려면 세 개의 플레이트에서 계산된 콜로니 수를 평균합니다. 희석 계수에 따라 평균 식민지 수를 곱하고 알리인용 양으로 나눕니다. 예를 들어, 평균 65개의 콜로니가 0.1mL의 용액 6(T6)으로 접종된 플레이트에 계산된 경우 이전에 설명한 공식은 650,000,000 CFU/mL과 같습니다.
격리된 식민지는 이제 종 정체성을 결정하기 위해 농축 소사에 사용하기 위해 각 플레이트에서 선택할 수 있습니다.

Application and Summary

도금에 의한 세균열및 균주 격리는 표적 유기체의 관리 가능한 농도가 필요합니다. 따라서 성공적인 도금은 직렬 희석에 달려 있습니다. 이와 같이, 전술한 기술은 미생물 검사 및 실험의 초석으로 남아 있습니다. 설계에 의해 간단하지만, 희석 인자 및 도금 기술은 각 방법의 무결성을 손상시키지 않고 결과를 강화하기 위해 실험자에 의해 수정 될 수있다. 세균 성장의 4 단계를 플롯 원하는 미생물을 특성화 할 때 도움이 될 수 있습니다. 이러한 단계, 지연, 로그, 고정 및 죽음은 세균 복제의 변화로 표시됩니다. 지연 단계는 생리적 적응으로 인한 느린 성장을 특징으로하며, 로그 단계는 실행 가능한 세포에서 기하급수적 상승을 특징으로하는 최대 증식의 기간이며, 정지 단계는 환경 적 제한 및 독소 축적으로 인해 세포 수가 떨어지기 전에 도달합니다. 이는 시간_0에서 시작하여 총 8시간 동안 시간당 연속적으로 희석(또는 혼동을 피하기 위한 1단계 희석) 솔루션_0을 통해 달성할 수 있습니다(솔루션_0은 각 희석 후 흔들리는 인큐베이터로 반환되어야 합니다). 시간_0의 단일 희석에 대한 CFU / ml의 로그_10을 계산하고 Y 축에 플롯. 샘플 시간_1에 대해 이 계산을 반복합니다(시간_0과동일한 희석 계수를 사용하여 CFU/mL을 계산해야 합니다). 매번(시간₁-시간_8)이X축에 플롯될 때까지 반복합니다.

References

Allen, M.E., Gyure, R.A. (2013) An Undergraduate Laboratory Activity Demonstrating Bacteriophage Specificity. Journal of Microbial Biological Education 14: 84-92.
Ben-David, A., Davidson, C.E. (2014) Estimation Method for Serial Dilution Experiments. Journal of Microbiological Methods 107:214-221.
Goldman, E., Green, L.H. (2008) Practical Handbook of Microbiology.
Koch, R. (1883) New Research Methods for Detection of Microcosms in Soil, Air and Water.
Lederberg, J., Lederberg, E.M. (1952) Replica Plating and Indirect Selection of Bacterial Mutants. Journal of Bacteriology 63:399-406
Pepper, I., Gerba, C., Ikner, L. (2019) Bacterial Growth Curve Analysis and its Environmental Changes. JoVE Science Education Database. Environmental Microbiology.
Sanders., E.R. (2012) Aseptic Laboratory Technique: Plating Methods. JoVE 63:e3063.

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1. 셋업

모든 재질을 나열하는 플로우 차트, 단계별 실험 프로토콜 및 소모품을 폐기하는 방법은 실험실 노트북에 작성하고 실험 작업 공간 근처에 보관해야 합니다.
작업 공간은 적절한 방부제 (70 % 에탄올)로 살균되어야하며 실험자는 노출 이상으로부터 보호하는 깨끗한 실험실 의류를 착용하여 오염 위험을 완화해야합니다. 적합한 의류에는 실험실 코트, 라텍스 또는 니트릴 장갑, 구글, 호흡보호구 및 폐쇄 신발이 포함되나 이에 국한되지 않습니다. 항상 무균 기술을 유지하는 것이 중요합니다.
식염수 0.45%의 90mL를 준비합니다. 깨끗한 졸업 실린더를 사용하여 멸균 수의 90mL를 측정하고 0.45 %의 식염수로표시된 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크로 전송합니다. 무게 .405 g의 염화 나트륨 (시그마 알드리치 NaCl S9888) 라벨 플라스크에 추가 0.45% 식염수. 솔루트가 보이지 않게 될 때까지 반복적으로 소용돌이치는 다.
완료되면 실험자는 모든 표면을 다시 살균하고 OSHA 지침에 따라 원치 않는 유기체, 희석제, 페트리 접시 또는 일회용 접종 루프를 폐기해야 합니다. 실험실 의류는 손을 씻기 전에 제거 할 수 있습니다.

2. 미디어 준비

원하는 유기체의 재배에 적합한 미디어를 선택합니다. 대부분의 시나리오에서 국물은 충분한 세균 성장을 가능하게 합니다. 위노그라드스키 프로토콜의 유기체가 여기에서 원하기 때문에 탄산칼슘, 황, 셀룰로오스 및 진흙으로 구성된 컬럼이 조립되어 7일 동안 방해받지 않고 방치되었습니다. 명명된 컬럼은 호기성, 소음조및 혐기성 섹션으로 구분됩니다.
관심 있는 유기체를 도금하는 데 적합한 매체를 선택합니다. 미생물학 등급 의 한천을 사용한 액체 매체의 보충은 일반적으로 응고제로 사용됩니다. LB 배지/한천은 외명한 컬럼의 호기성, 미세 열병및 혐기성 부위로부터 샘플을 수확할 때 충분합니다. 참고: 마이크로에어로필릭 부위의 샘플은 이 절차를 위해 수확되지 않았습니다. 그러나, 이러한 유기체는 촛불 항아리에서 재배되어야한다. 밀봉하기 전에이 재배 챔버에 촛불을 도입하면 미세 에어로포릭 증식에 적합한 낮은 산소 환경을 만듭니다.
250mL를 준비하고 자하기 때문에 500mL(또는 그 이상) Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 오토클레이브 시 종기를 방지하십시오. "국물"과 다른 하나는 "Agar"라고 레이블을 지정합니다.
제조업체 농도 권장 사항을 따라 각 솔루션을 만드는 데 필요한 미디어 양을 결정합니다. 여기에서 사용되는 LB Agar는 25g/L과 초순수를 결합하여 제조합니다. 250mL의 부피는 6.25 LB Agar/250 mL 물의 용액이 필요합니다. 마찬가지로, LB 국물은 LB 국물과 물의 동일한 비율을 결합하여 제조된다. 고화제로 보충되지 않기 때문에 냉각시 굳어지지 않습니다.
미디어를 계량하고 제조업체 권장 사항과 일치하는 비율로 물과 혼합합니다. "Agar"라고 표시된 플라스크에 6.25g의 LB 아가를 추가하고 6.25g의 LB 국물을 "국물"이라고 표시된 플라스크에 추가합니다. 각 플라스크에 250mL 초순수를 추가합니다.
각 플라스크 위에 알루미늄 호일을 감싸고 오토클레이브를 사용하여 121°C, 15psi에서 최소 15분 동안 미디어를 살균합니다.
내열 장갑이나 패드를 사용하여 사이클이 완료되면 오토클레이브에서 플라스크를 제거하고 40-50°C 수조에 넣습니다.
적절한 온도에 도달하면 "국물"이라고 표시된 플라스크의 내용을 250mL Erlenmeyer 또는 라운드 하단 플라스크에 붓습니다. 250 mL 플라스크 "솔루션_0"에레이블을 지정합니다.
10, 100mm x 15mm 멸균 페트리 접시를 얻고 날짜, 이름, 사용되는 미디어의 종류 및 유기체가 수확될 위노그라드스키 기둥 영역으로 라벨을 붙입니다.
수조에서 "Agar"라고 표시된 플라스크를 제거하고 10개의 페트리 요리에 붓기 시작합니다. 각 접시에 15mL 이상을 추가해서는 안 됩니다. 이는 또한 정확도를 높이기 위해 피페터 및 25mL 세로지컬 파이펫으로 수행될 수 있다. 멸균 파이펫 팁을 사용하여 존재하는 거품을 제거한 다음 플레이트 뚜껑으로 덮고 밤새 고형화하십시오.

3. 희석 제고

랙에 20mL 이상을 저장할 수 있는 10개의 테스트 튜브를 준비하고 T1-T10에 라벨을 부착합니다. 각 튜브 수는 희석 계수와 일치한다(즉, T4 = 1x10^-4 또는 0.0001 또는 1/10,000번째 재고 농도)에 해당한다.
파이프 9 mL의 0.45% 식염수 각각에 10 개의 시험 관.
식염수 블랭크는 이제 오토클레이브에 의해 멸균될 준비가 되었습니다. 알루미늄 호일을 사용하여 10개의 테스트 튜브를 각각 덮은 다음 오토클레이브 호환 테스트 튜브 랙으로 옮기습니다. 121°C, 15 psi에서 최소 15분 동안 멸균하십시오.
내열 장갑을 사용하여 블랭크를 제거하고 식힙니다. 튜브가 실온에 도달하거나 터치를 식힐 때 필요할 때까지 4 °C에서 덮고 보관하십시오.

4. 대상 유기체 의 재배

이전에 줄무늬 플레이트또는 냉동 재고의 50 μL에서 단일 콜로니와 "용액_0"을접종합니다. 접종된 "용액_0"을흔들림(필요한 경우)으로 밤새 37°C 인큐베이터에 배치하여 대상 유기체 시간을 복제할 수 있습니다. (참고: 플라스크는 오염을 방지하기 위해 덮여 있어야 합니다. 대상 유기체가 에어로빅인 경우 멸균 거즈와 면 플러그를 사용하여 오염을 방지하십시오. 위노그라드스키 컬럼의 영역을 평가하는 경우 원하는 각 영역(이 연구의 목적을 위해 에어로빅 및 혐기성)에서 1그램을 제거하고 5.3단계로 진행하기 전에 T1에서 다시 중단하십시오.

5. 직렬 희석

인큐베이터에서 "영양 국물"이라고 표시된 플라스크를 얻고 힘차게 흔들어 줍니다.
"용액_0"의파이프 1 mL은 T1라벨이 있는 시험관으로 들어갔다. 소용돌이 T1. 위노그라드스키를 평가하는 경우 원하는 영역의 1그램의 무게를 측정하고 소용돌이전에 T1에 추가합니다. (참고: 1 mL은 단순성으로 사용되며, 희석제의 더 작거나 더 큰 볼륨도 사용될 수 있습니다).
테스트 튜브 T1에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T2에 추가합니다. 소용돌이 T2.
테스트 튜브 T2에서 1mL를 제거하고 테스트 튜브 T3에 추가합니다. 소용돌이 T3.
테스트 튜브 T3에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T4에 추가합니다. 소용돌이 T4.
테스트 튜브 T4에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T5에 추가합니다. 소용돌이 T5.
테스트 튜브 T5에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T6에 추가합니다. 소용돌이 T6.
테스트 튜브 T6에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T7에 추가합니다. 소용돌이 T7.
테스트 튜브 T7에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T8에 추가합니다. 소용돌이 T8.
테스트 튜브 T8에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T9에 추가합니다. 소용돌이 T9.
테스트 튜브 T9에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T10에 추가합니다.

6. 스프레드 도금

T1에서 희석된 시료의 파이프 100 μL을 페트리 접시에 직접 스페트합니다. 이 단계는 각 튜브에 대해 반복될 필요는 없지만, 반복될 필요는 없습니다.
멸균, 일회용 확산 막대 또는 화염을 얻어서 유리 확산 막대를 살균합니다. 시계 방향/시계 반대 방향으로 동작하면 퍼지는 막대의 수평 부분을 미끄러져 페트리 접시 내에서 샘플을 동등하게 분배합니다.
평가할 위노그라드스키 열의 각 영역에 대해 반복합니다.
플레이트를 37°C 인큐베이터에 24시간 동안 배양합니다. 혐기성 유기체의 경우 혐기성 챔버를 사용하십시오.

7. 줄무늬

대상 유기체의 적절한 희석을 선택합니다. 예를 들어, 솔루션_4는 초기 농도의 1/10,000 희석을 산출합니다. 전형적으로, 1/1,000th(T3/솔루션), 1/1,000,000th(T6/솔루션₆₎및 1/1,000,000,000th(T9/솔루션 _9)의희석을 통해 미생물을 예중화하도록 평가된다.
플라스틱 멸균 일회용 접종 루프 또는 10초 이상 불에 불이 붙은 재사용 가능한 금속 접종 루프를 사용하여 5단계에서 원하는 용액에 담가 두세요. 보정된 접종 루프는 0.01 mL를 전송해야 합니다. (주의: 화염 루프가 열에서 제거한 직후 박테리아에 연락하는 것을 허용하지 마십시오)
한쪽에 페트리 접시 커버를 약간 올려 서 접종 루프만 한천에 접근할 수 있습니다. 지그재그 방식으로 미디어 상단을 가로질러 접종루프를 미끄러지듯 미끄러지며 한천을 손상시키지 않도록 주의하세요. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
새로운 일회용 접종 루프를 사용하거나 재사용 가능한 루프를 다시 소독하십시오.
플레이트를 약 1/3rd(~118°)로 회전시키고 지그재그 동작의 빈도를 줄입니다.
다시 말하지만, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 최종 시간을 회전하기 전에 금속 루프를 다시 살균하고 지그재그 주파수를 다시 한 번 줄입니다. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
7.2 - 7.6을 반복하여 3개의 다른 희석을 위해 적어도 3개의 페트리 요리가 줄지어 서 있거나, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 재사용 가능한루프(그림 2)를다시 불태울 때까지 반복한다.
줄무늬 페트리 요리를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다. 혐기성 유기체의 경우, 항예실 챔버를 사용합니다.

8. 데이터 분석 및 결과

배양은 7일 위노그라드스키 기둥의 소산화 및 무산소 영역에서 수확되었다. 이 구역은 각각 이종국 및 철 산화 혐기성에 적합합니다.
컬럼 이출은 LB Agar 플레이트에 줄무늬 또는 확산되기 전에 연속적으로 희석되었습니다.
줄무늬는 평가 된 위노 그라드 스키 지역의 각에서 혼합 인구를 공개했다. 스프레드 플레이트는 비슷한 결과를 낳았습니다.
CFU/mL 또는 CFU/g를 계산하려면 세 개의 플레이트에서 계산된 콜로니 수를 평균합니다. 희석 계수에 따라 평균 식민지 수를 곱하고 알리인용 양으로 나눕니다. 예를 들어, 평균 65개의 콜로니가 0.1mL의 용액 6(T6)으로 접종된 플레이트에 계산된 경우 이전에 설명한 공식은 650,000,000 CFU/mL과 같습니다.
격리된 식민지는 이제 종 정체성을 결정하기 위해 농축 소사에 사용하기 위해 각 플레이트에서 선택할 수 있습니다.

건너뛰기...

0:01

Concepts

3:54

Media Preparation

5:35

Diluent Preparation

6:18

Cultivation of the Target Organism

6:59

Serial Dilution and Spread Plating

9:42

Data Analysis and Results

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