Name: in vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using ivis spectrum
Uploaded: 2009-04-29T00:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum at JoVE.com

Een grote verscheidenheid van luciferase expressie kanker cellijnen kan gebruikt worden voor pre-klinisch onderzoek in muismodellen. Deze cellen zijn bedoeld als een pathogeen-vrij bevroren cultuur, die gemakkelijk zal in standaard media groeien zonder de noodzaak voor selectie markers. Voor ons experiment, zullen we gebruik maken van de 4T1-luc2 muriene mammatumor cellijn, die het luciferase-gen dat dient als een optische indicator van genexpressie of tumorgenesis in vivo uitdrukt. Wij zullen luciferase expressie om de groei van de primaire tumor niet-invasief track, maar ze kunnen ook worden gebruikt om te lokaliseren en monitoren metastatische laesies. Luciferase-activiteit moet worden geverifieerd voor de injectie, en om dit te doen, is een 90% confluent fles geoogst door trypsinebehandeling en vervolgens geteld. 50.000 cellen worden vervolgens afgeleverd in een putje van een microtiterplaat en seriële verdunningen worden uitgevoerd. Luciferine wordt toegevoegd aan het putten op 150ug per ml en geïncubeerd gedurende 2 minuten. De microplaat kan worden afgebeeld in IVIS of een lichtgevende plaat lezer tot expressie te bepalen. Deze cellijn drukt tot 6500 fotonen per seconde per cel, maar elke expressie niveau boven de 500 fotonen per seconde per cel met succes kunnen worden afgebeeld in vivo. Nu we cellen van optimale activiteit hebben, kunnen we overgaan tot de subcutane injectie stap. Met het oog op een optimale detectie van de tumor te vergemakkelijken, maken we gebruik van een athymische immuungecompromitteerde naakt muizenstam. Voorafgaand aan de injectie, de dieren zijn verdoofd te zijn voor diepe anesthesie. Vervolgens zullen injecteren tot 250.000 cellen in 100ul PBS worden subcutaan geïnjecteerd in de flank. Laad de cellen in een 1 ml injectiespuit en bevestig een 26 gauge naald. Til de huid met een tang om een ​​&quot;tent&quot; te maken en injecteren van de cellen aan de basis. De nieuw geïnjecteerde cellen kunnen direct worden afgebeeld. In elke opnamesessie een totaal van 150 mg van Luciferine per kg lichaamsgewicht wordt dan toegediend via twee injecties in de buikholte. In dit onderzoek worden dieren afgebeeld 10 minuten na de injectie Luciferine om een ​​consistente foton flux te garanderen. We laten u deze in de volgende stap. Luciferine kinetiek kan variëren van dag tot dag. In dit specifieke model, afmeting van 10 minuten na de injectie Luciferine gaf een resultaat binnen een bereik van 15% variabiliteit. Voor ons experiment zullen we gebruik maken van de IVIS Spectrum in vivo imaging systeem maakt gebruik van een back-uitgedunde Charge Coupled Device afgekoeld tot -90 ° C tot maximale gevoeligheid te bereiken. Ter ondersteuning van absolute kwantificatie, het systeem meet donkere lading tijdens het down-time en draait een zelf-calibratie tijdens de initialisatie. Om te beginnen imaging, initialiseren van de IVIS-systeem (een klik) en zet de imaging parameters voor het experiment. Selecteer gezichtsveld voor het aantal dieren dat wordt afgebeeld. Tot 5 dieren kunnen worden gehandhaafd in het instrument met behulp van de geïntegreerde verdoving spruitstuk. Het podium is op een constante 37 ° C tot lichaamstemperatuur te handhaven in de dieren. Een ECG-poort is voorzien om de gezondheid van dieren te controleren tijdens stressvolle procedures. In Living Image software, belichtingstijd, f-stop en pixel binning kunnen worden geoptimaliseerd op basis van het expressieniveau van de cellijn. Deze instellingen kunnen worden gewijzigd op elk moment tijdens een experiment zonder impact op de kwantitatieve resultaat. IVIS verwerft een fotografisch beeld van het dier onder wit licht en een kwantitatieve bioluminescente of fluorescerende signaal, dat wordt overlay op het beeld. De bioluminescente signaal wordt uitgedrukt in fotonen per seconde en wordt weergegeven als een intensiteit kaart. De afbeelding wordt aangepast aan een optimaal contrast en resolutie in het beeld te bieden zonder de kwantificatie. Luminescentie van de cellen kan worden gemeten op de plaats van injectie met een regio van belang tool. Meetgegevens worden weergegeven in de tabel, samen met alle experimentele parameters met betrekking tot de foto te maken die kunnen worden opgeslagen of geëxporteerd voor analyse Meerdere beelden kunnen worden verworven en vergeleken in longitudinale studies met betrekking tot seconde of maanden, afhankelijk van de aard van het experiment. Wij meten foton flux van de tumor op tijdstip nul en monitor voor 4 weken met een beeldvorming bij bi-wekelijkse intervallen. Foton flux van de tumor is evenredig aan het aantal levende cellen die luciferase zo bioluminescentie correleert direct met omvang van de tumor. Op 5 dagen na implantatie van de tumor is nog niet voelbaar, maar de cellen kunnen worden gekwantificeerd door middel van bioluminescentie en de tumor wordt gezien als actief groeiende. In dit stadium van de bioluminescentie signaal is veel Stronger. De belichtingstijd, f-stop en pixel binning kan worden aangepast zodat het beeld duidelijk is en de camera doet verzadigen niet. IVIS compenseert automatisch voor de veranderingen in het licht collectie, zodat deze metingen kunnen worden vergeleken met die vroeger en later verzameld in het experiment. Op 7 dagen na implantatie tumoren worden voelbaar voor de eerste keer en bioluminescentie metingen al tot zeven dagen van gegevens. Op de 28e dag na de implantatie, zijn tumoren worden necrotische en cellen beginnen te sterven. Tumorgrootte geschat door remklauw meting niet merkbaar veranderen, maar luminescentie van de tumor zal afnemen aangeeft celdood. Remklauw metingen en bioluminescentie meting kan worden voortgezet tot een humane eindpunt is bereikt. Tumor necrose ten gevolge van hypoxie of behandelingen wordt aangegeven door een verminderde bioluminescentie, zelfs als zij niet de tumormassa te reduceren.

Ik wil om te verzekeren dat alle experimenten uitgevoerd om de Journal of Gevisualiseerde Experimenten artikel te produceren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal protocol 060 goedgekeurd door de Institutional Animal Care en Comite (IACUC) op Remklauw Life Sciences, Alameda CA Jae Kim, Ph gebruik . D., IACUC voorzitter, Caliper Life Sciences.

in vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using ivis spectrum

4T1 muis mammatumor cellen kunnen subcutaan geïmplanteerd worden in nu / nu muizen voelbare tumoren vormen in 15 tot 20 dagen. Dit xenograft tumor model is waardevol voor de pre-klinische in vivo evaluatie van de vermeende antitumor verbindingen. De 4T1 cellijn is ontworpen om constitutief drukken de vuurvlieg luciferase gen (luc2). Bij de muizen die 4T1-luc2 tumoren worden geïnjecteerd met Luciferine de tumoren geven een visueel licht signaal dat kan worden gecontroleerd met behulp van een gevoelige optische beeldvorming systeem zoals de IVIS Spectrum. Het foton flux van de tumor is evenredig aan het aantal lichtgevende cellen en het signaal kan worden gemeten om tumorgroei en ontwikkeling te volgen. IVIS is gekalibreerd om absolute kwantificering van de lichtgevende signaal en longitudinale studies kunnen worden uitgevoerd gedurende vele maanden en over meerdere orden van grootte het signaal, zonder afbreuk te doen aan het kwantitatieve resultaat. Groei van de tumor kan worden gecontroleerd op een aantal dagen door bioluminescentie voordat de tumorgrootte tastbaar of meetbaar door de traditionele fysieke middelen. Deze snelle controle kan inzicht geven in vroege gebeurtenissen in tumor ontwikkeling of leiden tot kortere experimentele procedures. Tumor celdood en necrose ten gevolge van hypoxie of medicamenteuze behandeling in een vroeg stadium aangegeven door een vermindering van de lichtgevende signaal. Deze cel dood zou niet gepaard gaan met een vermindering van de omvang van de tumor zoals gemeten door fysieke middelen. De mogelijkheid om vroeg gebeurtenissen te zien in tumor necrose heeft grote invloed op de selectie en ontwikkeling van therapeutische middelen. Kwantitatieve beeldvorming van de groei van tumoren met behulp van IVIS zorgt voor een nauwkeurige kwantificering en versnelt het experimentele proces voor het genereren van resultaten.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum at JoVE.com

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammatumor cellen die luciferase worden subcutaan geïmplanteerd in muizen en gevisualiseerd met behulp van optische beeldvorming om tumoren groei en ontwikkeling niet-invasief in een longitudinale studie monitor.

In vivo Bioluminescent Imaging van borsttumoren gebruik van IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Dendra2 Photoswitching door de borstklieren Imaging venster

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

In vivo beeldvorming van Deep Corticale lagen met behulp van een microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Borstklieren Epitheliale Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Single-molecule Imaging van genregulatie<em&gt; In vivo</em&gt; Met behulp van Cotranslational Activering door splitsing (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...