Name: in vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using ivis spectrum
Uploaded: 2009-04-29T00:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum at JoVE.com

Una amplia variedad de luciferasa que expresan las líneas celulares de cáncer puede ser utilizado para la investigación preclínica en modelos de ratón. Estas células se proporcionan como una cultura congelada libre de patógenos, que rápidamente crecerá en los medios de comunicación estándar, sin necesidad de marcadores de selección. Para nuestro experimento, vamos a utilizar el 4T1-luc2 murino línea de células tumorales mamarias, que expresa el gen de la luciferasa, que sirve como un indicador óptico de la expresión génica o tumorgenesis in vivo. Vamos a usar la expresión de luciferasa para observar el crecimiento del tumor primario, de forma no invasiva, pero también se puede utilizar para localizar y controlar las lesiones metastásicas. La actividad luciferasa debe ser verificada antes de la inyección, y con el fin de hacer esto, un frasco de 90% confluentes se cosechan por tripsinización y contaron. 50.000 células se entrega en un solo pozo de una placa de microtitulación y diluciones seriadas se llevan a cabo. Luciferina se añade a los pozos de 150ug por ml y se incubó durante 2 minutos. La microplaca se pueden leer en IVIS o un lector de placas luminiscentes para determinar los niveles de expresión. Esta línea celular expresa hasta 6500 fotones por células por segundo, pero cualquier nivel de expresión por encima de 500 fotones por segundo por cada célula se pueden visualizar con éxito en vivo. Ahora que tenemos las células de la actividad óptima, podemos pasar a la etapa de inyección subcutánea. Con el fin de facilitar la detección óptima del tumor, estamos utilizando una cepa atímicos inmunodeficientes ratón desnudo. Antes de la inyección, los animales son anestesiados para llevar a cabo para la anestesia profunda. A continuación vamos a inyectar hasta 250.000 células en 100 ul de PBS se inyectan por vía subcutánea en el flanco. La carga de las células en una jeringa de 1 ml y ponga una aguja de calibre 26. Levante la piel suavemente con unas pinzas para hacer una &quot;tienda&quot; e inyectar las células en la base. Las nuevas células inyectadas se pueden visualizar de inmediato. En cada sesión de imágenes de un total de 150 mg de luciferina por kg de peso luego se administra a través de dos inyecciones en la cavidad peritoneal. En este estudio, los animales son imágenes 10 minutos después de la inyección luciferina para asegurar el flujo de fotones coherentes. Le mostraremos esto en el próximo paso. Cinética de la luciferina puede variar de un día para otro. En este modelo en particular, la medición de 10 minutos después de la inyección luciferina dio un resultado dentro de un rango de 15% de la variabilidad. Para nuestro experimento vamos a utilizar el espectro IVIS en vivo sistema de imágenes utiliza un back-adelgazado dispositivo de carga acoplada refrigerados a -90 ° C para conseguir la máxima sensibilidad. Para apoyar la cuantificación absoluta, el sistema mide la carga oscura durante el tiempo de inactividad y ejecuta una auto-calibración durante la inicialización. Para empezar la imagen, inicializar el sistema IVIS (un clic) y establecer los parámetros de imagen para el experimento. Seleccione el campo de visión para el número de animales que se explora. Hasta 5 animales se pueden mantener en el instrumento a través del colector de anestésico integral. El escenario está en una constante de 37 ° C para mantener la temperatura corporal en los animales. Un puerto de ECG se proporciona para controlar la salud de los animales durante los procedimientos estresantes. Vivir en el software de imagen, tiempo de exposición, diafragmas y pixel binning se puede optimizar en función del nivel de expresión de la línea celular. Estos ajustes se pueden cambiar en cualquier momento durante un experimento sin afectar el resultado cuantitativo. IVIS adquiere una imagen fotográfica de los animales con luz blanca y una señal cuantitativa bioluminiscentes o fluorescentes, que se superpone en la imagen. La señal bioluminiscente se expresa en forma de fotones por segundo y se muestra como un mapa de intensidad. La visualización de la imagen se ajusta para proporcionar un contraste óptimo y la resolución de la imagen sin afectar a la cuantificación. Luminiscencia de las células se puede medir en el lugar de inyección con una región de la herramienta de interés. Los datos de medición se muestran en la tabla, junto con todos los parámetros experimentales relacionados con la captura de imágenes que se pueden guardar o exportar para su análisis Varias imágenes pueden ser adquiridas y comparados en los estudios longitudinales que cubren segundos o meses, dependiendo de la naturaleza del experimento. Vamos a medir el flujo de fotones del tumor en el momento cero y el monitor durante 4 semanas con imágenes a intervalos de dos semanas. Flujo de fotones del tumor es proporcional al número de células vivas que expresan luciferasa para la bioluminiscencia se correlaciona directamente con el tamaño del tumor. A los 5 días posteriores a la implantación del tumor no es aún palpable, pero las células pueden ser cuantificados a través de la bioluminiscencia y el tumor se ve que es de crecimiento activo. En esta etapa la señal de bioluminiscencia es mucho stronger. El tiempo de exposición, f-stop y pixel binning se puede ajustar para que la imagen es clara y la cámara no se sature. IVIS compensa automáticamente los cambios en la recolección de la luz así que estas medidas se puede comparar con los obtenidos antes y después del experimento. A los 7 días después del implante tumores son palpables, por primera vez y bioluminiscencia medida ya ha generado 7 días de datos. A los 28 días posteriores a la implantación, los tumores se están convirtiendo en necrosis y las células comienzan a morir. Estima que el tamaño del tumor mediante un calibre de medición no cambia apreciablemente, pero la luminiscencia del tumor se reducirá lo que indica la muerte celular. Mediciones de la pinza y la medición de bioluminiscencia se puede continuar hasta un punto final que se alcance humano. Necrosis del tumor debido a los regímenes de la hipoxia o el tratamiento será indicado por la bioluminiscencia reducido, incluso si no reducen la masa tumoral.

Me gustaría asegurar que todos los experimentos realizados para producir el artículo del Journal of experimentos visualizados se realizaron en cumplimiento del Protocolo de animales 060 aprobado por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) en Caliper Life Sciences, Alameda CA Jae Kim, Ph . D., Presidente IACUC, Caliper Life Sciences.

in vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using ivis spectrum

Células 4T1 de tumor mamario de ratón puede ser implantado subcutáneamente en ratones nu / nu para formar tumores palpables en 15 a 20 días. Este sistema modelo de xenoinjerto tumoral es útil para la pre-clínica en la evaluación in vivo de compuestos antitumorales putativo. La línea celular 4T1 se ha diseñado para expresar constitutivamente el gen de la luciferasa de luciérnaga (luc2). Cuando ratones portadores de tumores 4T1-luc2 son inyectados con luciferina los tumores emiten una señal de luz visible que pueden ser monitoreados utilizando un sistema sensible de imágenes ópticas, como el espectro de IVIS. El flujo de fotones del tumor es proporcional al número de células que emiten luz y la señal puede ser medida para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo. IVIS está calibrada para permitir la cuantificación absoluta de la señal bioluminiscente y los estudios longitudinales se pueden realizar durante muchos meses y en varios órdenes de magnitud de la señal, sin comprometer el resultado cuantitativo. El crecimiento del tumor se puede controlar durante varios días antes de la bioluminiscencia por el tamaño del tumor se hace palpable y mensurable por los tradicionales medios físicos. Este monitoreo rápido puede dar una idea de los primeros eventos en el desarrollo de tumores o dar lugar a procedimientos más cortos experimentales. Muerte de las células del tumor y necrosis debido al tratamiento de la hipoxia o fármaco está indicado temprano por la reducción de la señal bioluminiscente. Esta muerte celular no puede ir acompañado de una reducción en el tamaño del tumor, medido por medios físicos. La capacidad de ver los primeros eventos en necrosis tumoral tiene un impacto significativo en la selección y desarrollo de agentes terapéuticos. Imagen cuantitativa del crecimiento tumoral con IVIS ofrece la cuantificación precisa y acelera el proceso experimental para generar resultados.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum at JoVE.com

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mamaria células tumorales que expresan luciferasa se implanta de forma subcutánea en ratones y se visualizan con imágenes ópticas para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo de forma no invasiva en un estudio longitudinal.

En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Investigación

Biología

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...