Name: development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. at JoVE.com

Dit werk wordt gefinancierd door het NICHD / NIH (1R01HD053287) naar Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) te Vogt, en NHLBI / NIH (1R01HL088016) naar Tsang.

1) Opzetten van zebravis paringen en BCI behandeling. <ol><li> Twee dagen voorafgaand aan de behandeling, te identificeren homozygote mannen Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 zebravis en plaats individueel in de paring tanks 1. Voeg afscheider en een wild-type AB * vrouwelijke vissen en &#39;s nachts vertrekken paring kooien. </li><li> De volgende morgen te verwijderen van de afscheider, en het verzamelen van embryo&#39;s na 1 uur. Transfer embryo&#39;s tot 100mm gerechten met E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), oplossing en incubeer bij 28 ° C gedurende 6 uur. Verwijderen dode en onbevruchte embryo&#39;s, voeg verse E3 oplossing en incubeer overnacht. </li><li> Sorteer transgene embryo&#39;s voor soortgelijke fase (24hpf) en uniforme GFP expressie. Array embryo&#39;s individueel in elke well van een 96-well plaat. </li><li> Verwijder overtollig E3 oplossing met een micropipet. Voeg 200μl van de E3-oplossing met een multi-channel pipet in elk putje. </li><li> Voeg de volgende verbindingen zoals vermeld: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr ><td> Een </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Eindconcentraties zijn 1 uM, 5 urn, 10μM, 20μM, 25μM BCI in 1% DMSO. Afdekplaat in aluminium folie en incubeer gedurende 6 uur bij 28 ° C. </li></ol> 2) Geautomatiseerde beeldvorming van 96-wells platen en analyse. <ol><li> Voeg 10μl van tricaïne (0.61mM) aan elk putje te 30hpf embryo&#39;s verdoven. </li><li> Laad plaat in Molecular Devices Imagexpress Ultra. </li><li> Open Metaxpress software. Kies een configuratie met een 4x objectieve en maximale pinhole diameter, configureren laser autofocus tot op het bord bodem te detecteren, en bepalen een optimale Z-vliegtuig naar gebieden van belang op te sporen. Acquire beelden bij excitatie / emissie golflengtes van 488 / 525 nm (GFP). Stel scan gebied als een enkele site van 2000x2000 pixels (4 x 4 mm) zonder binning. Configureren laservermogen en krijgen zodanig dat helderste regio&#39;s in positieve controle beelden niet te verzadigen. Bevestig de juiste beeldacquisitie in verschillende positieve en negatieve controle putten. </li><li> Start plaat scan. Het instrument zal automatisch verwerven beelden van alle putten en archiveren in een SQL server database. </li><li> Upload beelden in Definiens Developer met behulp van de Cellenger applicatie module en een import filter dat beeldformaat en bestandsstructuur gegenereerd door de Molecular Devices Imagexpress Ultra-platform herkent. </li><li> Proces beelden met een speciaal ontworpen Cognition Network Technology-algoritme (ook wel een regelset). Het algoritme, die wij op maat ontwikkeld op basis van een recent gepubliceerde regelset 2, is ontworpen om automatisch te identificeren embryo, dooier, en hoofd, en om de helderheid en het gebied van GFP-expressie hoofd structuren te kwantificeren. Wells waarin geen embryo is geconstateerd of waar het hoofd niet ondubbelzinnig kan worden toegekend (bijvoorbeeld met een hoge toxiciteit compound of onscherp beelden) zijn uitgesloten van de analyse. Configureer het algoritme met behulp van een aantal negatieve controle foto&#39;s (voertuig behandeld) en de positieve controle beelden (BCI behandeld) zodanig dat het hoofd en de dooier correct worden geïdentificeerd in beide. Stel een &#39;head-structuren &quot;detectiedrempel als een veelvoud van de gemiddelde intensiteit dooier tot detectie van heldere structuren hoofd wedstrijden visuele waarneming. Parameters definiëren om te exporteren. In dit voorbeeld is de meest informatieve parameter was de totale geïntegreerde helderheid van GFP-positieve regio&#39;s in het hoofd, hierna genoemd &quot;total head-structuren helderheid&quot; (Figuur 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="figuur 1" /> Figuur 1 Grafiek depicitng De dosis-afhankelijke effecten van BCI op de GFP expressie in transgene embryo&#39;s. </li><li> Voer het algoritme op alle plaat beelden met behulp van de geïntegreerde job scheduler. De Definiens software maakt gebruik van distributed computing op meerdere processoren (&quot;motoren&quot;), waardoor gelijktijdige analyse van meerdere afbeeldingen. Het algoritme berekent de numerieke maatregelen op basis van de resultaten van de beeldanalyse, die worden opgeslagen in de database samen met een kopie van het bewerkte beeld, met een analyse toegepast. </li></ol> Representatieve resultaten: Nadat alle beelden worden geanalyseerd, kunnen de gegevens worden gevisualiseerd in Cellenger of geëxporteerd naar software van derden (Excel, GraphPad Prism) voor verdere analyse en grafische weergave. Figuur 2 toont gearchiveerde afbeeldingen scannen van behandelde een voertuig en een goed BCI-behandeld, met en zonder CNT-analyse toegepast. Figuur 1 documenten een dosis-afhankelijke effect van de BCI op de GFP-reporter genexpressie in Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryo&#39;s. De concentratie nodig is om een ​​half maximale respons (EC50) te lokken was ongeveer 12 uM. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="figuur 2" /> Figuur 2 Automatische foto-opname en analyse van transgene zebravis embryo&#39;s. (A) DMSO voertuig behandeld Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 embryo op 30hpf. (B) transgene embryo&#39;s die werden behandeld met 20μM BCI tonen toename van GFP expressie. (C) Afbeelding van embryo&#39;s van (A) na het draaien van Definiens regelset om GFP tot uitdrukking komen in het hoofd. Oranje vlekken aan te duiden waar de software GFP intensiteit van maatregelen. (D) Afbeelding van embryo&#39;s uit (B) na het draaien van Definiens regelset om GFP tot uitdrukking komen in het hoofd. Oranje vlekken aan te duiden waar de software GFP intensiteit van maatregelen. Merk op dat de regelset in staat was om een ​​uitgebreide gebied van GFP tot uitdrukking komen in de behandelde embryo.

<ol>
	<li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li></ol>

Een belangrijke factor die de doorvoer van de zebravis chemische schermen is het gebrek aan methodiek om systematisch te verwerken 96-well platen voor beeldvorming en analyse. Omdat beelden van meercellige organismen zijn complexe, laag contrast, en heterogeen van aard, bestaande beeldanalyse algoritmen niet te detecteren en te kwantificeren specifieke structuren in het organisme. De meeste gepubliceerde zebravis chemische schermen dus mogelijk voor visueel onderzoek van de individuele putten door toegewijde personeel tijdens de gehele procedure. Dit voorkomt meestal de generatie van numerieke uitlezingen en een volledige archivering van het scherm beelden en gegevens. Bovendien, handmatige evaluatie elimineert een aantal belangrijke voordelen van het image-based screening, namelijk de mogelijkheid om retrospectieve analyses van het scherm de prestaties te voeren, om fenotypische veranderingen die niet de primaire focus van de screening campagne (bv. toxiciteit of defecten in de ontwikkeling) het onderzoeken en over te steken -referentie-screening van gegevens met het verleden of de toekomst schermen met dezelfde compound bibliotheek. In dit rapport belichten we de methodologie voor automatische beeldvorming en analyse van de zebravis embryo&#39;s in multiwell platen zonder tussenkomst van de gebruiker. We automatische beeld vast te leggen op een ImageXpress Ultra confocale laser scanning lezer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) om beeld Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryo&#39;s in 96 wells platen en ontwikkelde een beeldanalyse algoritme gebaseerd op Cognition Definiens &#39;Network Technology gekwantificeerde GFP uitdrukking in de hoofden van transgene embryo&#39;s. De methode geleverd gesorteerd reacties en gekwantificeerd de in vivo activiteit van een klein molecuul activator van FGF signalering. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de epifluorescentie-based ArrayScan II (Cellomics Inc, Pittsburgh PA) waaruit blijkt dat het mogelijk is om geautomatiseerde beeldopname van de zebravis embryo&#39;s uitvoeren op een verscheidenheid van commercieel beschikbare plaat lezers 2. De ontwikkeling van de methodologie voor het automatisch analyseren van meercellig organisme beelden niet langer nodig voor visuele scoren door een menselijke waarnemer en in staat het genereren en archiveren van numerieke gegevens en beelden voor de retrospectieve analyse en vergelijkingen met toekomstige schermen.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (MS222)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Cat.# A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Tonen we de toepassing van beeld-gebaseerde high-content screening (HCS) methodologie om kleine moleculen die de FGF / RAS / MAPK route kan moduleren in de zebravis embryo&#39;s te identificeren. De zebravis embryo is een ideaal systeem voor in vivo high-content chemische schermen. De 1-dag oud embryo is ongeveer 1 mm in diameter en kan gemakkelijk worden geschaard in 96-well platen, een standaard formaat voor high throughput screening. Tijdens de eerste dag van de ontwikkeling, de embryo&#39;s zijn transparant met de meeste van de belangrijkste organen aanwezig is, waardoor visualisatie van weefsel de vorming tijdens de embryogenese. De volledige automatisering van zebravis chemische schermen is nog steeds een uitdaging, maar met name in de ontwikkeling van geautomatiseerde afbeelding acquisitie en analyse. We hebben eerder geleid tot een transgene verslaggever lijn die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot uitdrukking onder de controle van FGF activiteit en hun nut bewezen in de chemische-schermen<sup&gt; 1</sup&gt;. Om vast te stellen methodiek voor high throughput hele organisme screens, hebben we een systeem ontwikkeld voor automatische beeldvorming en analyse van de zebravis embryo&#39;s op 24-48 uur na de bevruchting (HPF) in 96-well platen<sup&gt; 2</sup&gt;. In deze video belichten we de procedures voor de arraying transgene embryo&#39;s in multiwell platen bij 24hpf en de toevoeging van een klein molecuul (BCI), dat FGF signalering hyperactivates<sup&gt; 3</sup&gt;. De platen worden geïncubeerd gedurende 6 uur gevolgd door de toevoeging van tricaïne om larven voorafgaand aan de automatische imaging verdoven op een Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocale HCS lezer. De beelden worden verwerkt door Definiens Developer software met behulp van een Cognition Network Technology algoritme dat we ontwikkeld voor het detecteren en expressie van GFP te kwantificeren in de hoofden van transgene embryo&#39;s. In dit voorbeeld hebben we aandacht voor het vermogen van het algoritme om dosis-afhankelijke effecten van de BCI maatregel op de GFP-reporter-gen expressie in de behandelde embryo&#39;s.

Watch this Scientific Journal Video about Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. at JoVE.com

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Wij rapporteren de ontwikkeling van een systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse van transgene zebravis embryo&#39;s in multiwell platen. Dit toont de mogelijkheid om dosisafhankelijke effecten van een klein molecuul, BCI, meten op fibroblast groeifactor reporter-gen expressie en leveren van technologie voor de oprichting van high-throughput zebravis chemische schermen.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatische Optical Heartbeat Analyse van kleine hart

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycanen in zebravis embryo&#39;s door metabole Labeling en Bioorthogonal Klik Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...