Iniziare misurando la concentrazione di cardiomiociti ventricolari di ratto neonatale utilizzando un emocitometro. Diluire la soluzione di sospensione cellulare a 3.000 cellule per millilitro, con alfa MEM contenente il 10% di FBS inattivato dal calore. Distribuire 100 microlitri di cardiomiocita ventricolare diluito in ciascun pozzetto delle piastre non adesive a 96 pozzetti della cellula.
Centrifugare le cellule per cinque minuti a 100 G e coltivarle per due o tre giorni nell'incubatore per colture cellulari, con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno di coltura dalle sfere di cardiomiociti di ratto seminate nella piastra non adesiva a 96 pozzetti. Quindi, trasferire le sfere di cardiomiociti da ciascun pozzetto in una provetta da 15 millilitri.
Centrifugare le sfere cardiomiocitarie e aspirare il surnatante. Quindi, lavali con un tampone ADS. Per facilitare il tracciamento delle cellule cardiomiocitarie nel ratto dopo l'attecchimento, colorare le cellule con PKH26.
Prima di centrifugare le cellule, monitorare lo sviluppo delle sfere di cardiomiociti bidim osservandole regolarmente al microscopio dopo la semina. Iniziare a preparare l'apparato di iniezione principale per un'iniezione di sfere di cardiomiociti neonatali utilizzando un ago calibro 29, lungo 50 millimetri, dotato di siringa. Collegare un ago per siringa a trasferimento di potenza da 18 gauge da un millilitro a un sottile tubo di polipropilene con bassa espandibilità del lume.
Aspirare l'acqua con una siringa e rimuovere tutte le bolle dalla siringa e dai tubi collegati. Ripeti l'operazione per un altro ago calibro 18. Quindi, collegare l'altro lato del tubo di trasferimento dell'alimentazione all'ago calibro 18 della stessa siringa da un millilitro.
Confermare l'avvenuta transizione di alimentazione spingendo uno stantuffo della siringa verso il basso e un altro stantuffo della siringa verso l'alto. Una volta terminato, posizionare la siringa in una pompa a siringa. Successivamente, impostare il sistema di raffreddamento collegando il tubo di rame strettamente arrotolato alla cella contenente parte della siringa per iniezione cellulare.
Lasciando 10 millimetri di tubo in eccesso ad entrambe le estremità. Collegare il tubo di rame al tubo di plastica flessibile prima di collegare le altre estremità del tubo di plastica a una pompa esterna. Riempi la linea con acqua di raffreddamento e immergi il tubo di rame in eccesso nel ghiaccio tritato per raffreddare l'acqua.
Questo sistema di raffreddamento mantiene la soluzione di sospensione delle celle nel cilindro a circa 2 gradi Celsius.