血球計算盤を使用して新生児ラット心室心筋細胞濃度を測定することから始めます。細胞懸濁液を 3 、 000 細胞/ミリリットルに希釈し、 10% の熱不活性 FBS を含むアルファ MEM を使用します。希釈した心室心筋細胞100マイクロリットルを、細胞の非粘着性96ウェルプレートの各ウェルに分配します。
細胞を100Gで5分間遠心分離し、細胞培養インキュベーターで2〜3日間培養し、5%二酸化炭素を摂氏37度で培養します。インキュベーション後、非粘着性の96ウェルプレートに播種したラット心筋細胞ボールから培地を吸引する。次に、心筋細胞ボールを各ウェルから15ミリリットルのチューブに移します。
心筋細胞ボールを遠心分離し、上清を吸引します。次に、ADSバッファーを使用して洗浄します。生着後のラットの心筋細胞の追跡を容易にするために、細胞をPKH26で染色します。
細胞を遠心分離する前に、播種後に定期的に顕微鏡で観察することにより、ビジム心筋細胞ボールの発生を追跡します。シリンジを装備した29ゲージ、長さ50mmの針を使用して、新生児心筋細胞ボール注射用の主注射装置の準備を開始します。18ゲージの1ミリリットルのパワートランスファーシリンジ針を、ルーメンの拡張性の低い細いポリプロピレンチューブに接続します。
シリンジを使用して水を吸引し、シリンジと接続されたチューブからすべての気泡を取り除きます。別の18ゲージの針についても繰り返します。次に、パワートランスファーチューブの反対側を同じ1ミリリットルシリンジの18ゲージの針に接続します。
1つのシリンジプランジャーを押し下げ、もう1つのシリンジプランジャーを上に押し上げて、電源の切り替えが成功したことを確認します。完了したら、シリンジをシリンジポンプにセットします。次に、セル注入シリンジの一部を含むセルにしっかりと巻かれた銅管を取り付けて、冷却システムを設定します。
両端に10ミリの余分なパイプを残します。プラスチックチューブのもう一方の端を外部ポンプに接続する前に、銅管をフレキシブルプラスチックチューブに接続します。ラインに冷却水を入れ、余分な銅管を砕いた氷に浸して水を冷やします。
この冷却システムは、シリンダー内の細胞懸濁液を摂氏約2度に維持します。