혈구계를 사용하여 신생아 쥐 심실 심근 세포 농도를 측정하는 것으로 시작합니다. 세포 현탁액을 3, 밀리리터 당 000 세포에 묽게하고, 10%heat 비활성화된 FBS를 포함하는 알파 MEM와 더불어. 희석된 심실 심근세포 100마이크로리터를 세포의 비접착식 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.
100 G.And에서 5 분 동안 세포를 원심 분리하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 세포 배양 인큐베이터에서 2-3 일 동안 배양합니다. 배양 후, 비접착성 96웰 플레이트에 파종된 Rat Cardiomyocyte ball에서 배양 배지를 흡인합니다. 그런 다음 각 웰에서 심근 세포 볼을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.
심근세포 볼을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 ADS 버퍼를 사용하여 세척하십시오. 생착 후 쥐의 심근 세포 추적을 용이하게 하려면 세포를 PKH26으로 염색합니다.
세포를 원심분리하기 전에 파종 후 정기적으로 현미경으로 관찰하여 비딤 심근 세포 공의 발달을 추적하십시오. 주사기가 장착된 29게이지, 50mm 길이의 바늘을 사용하여 신생아 심근세포 볼 주사를 위한 주 주입 장치 준비를 시작합니다. 18게이지 1밀리리터 동력 전달 주사기 바늘을 루멘 팽창성이 낮은 얇은 폴리프로필렌 튜브에 연결합니다.
주사기를 사용하여 물을 흡입하고 주사기와 연결된 튜브에서 모든 기포를 제거합니다. 다른 18게이지 바늘에 대해 반복합니다. 그런 다음 동력 전달 튜브의 다른 쪽을 동일한 1밀리리터 주사기의 18게이지 바늘에 연결합니다.
하나의 실린지 플런저를 아래로 밀고 다른 시린지 플런저를 위로 밀어 성공적인 동력 전환을 확인합니다. 완료되면 주사기를 주사기 펌프에 넣습니다. 다음으로, 촘촘하게 감긴 동관을 셀 주입 주사기의 일부가 들어있는 셀에 부착하여 냉각 시스템을 설정합니다.
양쪽 끝에 10mm의 초과 파이프를 남깁니다. 플라스틱 튜브의 다른 쪽 끝을 외부 펌프에 연결하기 전에 구리 튜브를 유연한 플라스틱 튜브에 연결하십시오. 라인에 냉각수를 채우고 여분의 구리 튜브를 으깬 얼음에 담가 물을 식힙니다.
이 냉각 시스템은 실린더의 셀 현탁액을 약 섭씨 2도로 유지합니다.
