Начните с измерения концентрации кардиомиоцитов желудочков новорожденных крыс с помощью гемоцитометра. Разбавляют раствор клеточной суспензии до 3 000 клеток на миллилитр, при этом альфа-МЭМ содержит 10% инактивированного при нагревании FBS. Распределите 100 микролитров разбавленного кардиомиоцита желудочков в каждую лунку неадгезивных 96-луночных планшетов клетки.
Центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 100 G. И культивируйте их в течение двух-трех дней в инкубаторе для клеточных культур с 5%-ным углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации аспирируют питательную среду из шариков кардиомиоцитов крыс, засеянных в неадгезивную пластину 96 лунок. Затем перенесите шарики кардиомиоцитов из каждой лунки в 15-миллилитровую трубку.
Центрифугируют шарики кардиомиоцитов и аспирируют надосадочную жидкость. Затем промойте их с помощью буфера ADS. Чтобы облегчить отслеживание клеток кардиомиоцитов у крысы после приживления, окрасьте клетки PKH26.
Перед центрифугированием клеток проследите за развитием шариков кардиомиоцитов бидима, регулярно наблюдая за ними под микроскопом после посева. Начните подготовку основного инъекционного аппарата для инъекции неонатального шарика кардиомиоцитов с помощью иглы 29 калибра и длиной 50 миллиметров, оснащенной шприцем. Подсоедините иглу шприца 18-го калибра объемом один миллилитр к тонкой полипропиленовой трубке с низкой расширяемостью просвета.
Аспирируйте воду с помощью шприца и удалите все пузырьки из шприца и подключенных трубок. Повторите то же самое для другой иглы 18 калибра. Затем подсоедините другую сторону трубки для передачи энергии к игле 18 калибра того же шприца объемом один миллилитр.
Подтвердите успешное переключение мощности, нажав на один поршень шприца вниз, а другой поршень шприца вверх. После этого поместите шприц в шприцевой насос. Затем настройте систему охлаждения, прикрепив плотно свернутую медную трубку к ячейке, содержащей часть шприца для инъекций ячейки.
Оставляя по 10 миллиметров лишней трубы на обоих концах. Подсоедините медную трубку к гибкой пластиковой трубке, прежде чем подключать другие концы пластиковой трубки к внешнему насосу. Наполните трубопровод охлаждающей водой, а излишки медной трубки погрузите в колотый лед, чтобы охладить воду.
Эта система охлаждения поддерживает температуру суспензии ячеек в цилиндре примерно на уровне 2 градусов Цельсия.