Начните с приготовления полимеризованного гелевого бутерброда. Снимите зажимы и слои бумажной ленты и медленно снимите расческу. Тщательно промойте лунки дистиллированной водой.
Правильно поместите гелевый бутерброд в вертикальный аппарат для электрофореза. Заполните верхний и нижний резервуары буфером TBE. Прогрейте пластины, выполнив предварительный запуск гель-электрофореза в течение не менее 30 минут при мощности 50 Вт.
Тем временем повторно суспендируйте высушенные образцы в пяти микролитрах буфера для загрузки денатурирующего геля. Затем с помощью небольшого шприца, наполненного буфером TBE, вымывайте мочевину из лунок геля. Теперь загрузите образцы в чистые лунки, обращая внимание на запах загрузки.
Запустите гель в течение двух часов при мощности 50 Вт или до тех пор, пока бромфенольный синий краситель не сойдет на 2/3 геля. После электрофореза выключите электропитание, аккуратно снимите стеклянный бутерброд и очистите стеклянные пластины. Поместите гель в гелевый имиджер для обнаружения флуоресценции олигонуклеотидных полос, меченных FAM.
После одного, четырех и 15 часов инкубации пять или 50 микромолярных Bsep 1 вступили в реакцию с двумя микромолярными образцами G4 TBA, одноцепочечной TBA и двухцепочечной TBA. Контрольные данные были загружены для каждого набора образцов. Субстрат G4 TBA показал только один аддукт алкилирования из-за доступности только G8 для алкилирования и последующего расщепления цепи.
Множественные аддукты и полосы продуктов расщепления наблюдались в одноцепочечных и двухцепочечных TBA, поскольку все гуанины были чувствительны к реакции Bsep. Зондирующая реакция и трис-буфер привели к неэффективному химическому картированию из-за присутствия нежелательных нуклеофилов, что привело к снижению проприоактивности. В образцах G4 TBA наблюдалось только образование аддукта без многоцепочечного расщепления.
Для одноцепочечных и двухцепочечных TBA только 24-часовая инкубация привела к фрагментации ДНК, что сравнимо с 15-часовой фрагментацией без Tris.
