При лентивирусной инфекции тарелируйте трипсинизированные клетки-мишени MPNST после их подсчета, поддерживая 2,5 миллиона клеток на 15-сантиметровую чашку. Трансдуцируют клетки с размороженным вирусом при 0,5 кратности инфекции, в присутствии пяти микрограммов на миллилитр катионного полимера. Трипсинизируйте клетки через три дня после добавления пуромицина.
Центрифугируйте половину популяции клеток при 200 G в течение пяти минут в настольной центрифуге. После повторного нанесения покрытия на вторую половину клеточной популяции выращивайте их в течение примерно семи удвоений популяции перед сбором и центрифугированием, как было продемонстрировано ранее. Разделите повторно суспендированную клеточную гранулу, соответствующую нужному времени, на две 15-миллилитровые полиметилпентеновые трубки.
Добавьте 500 микролитров 10% SDS на тюбик. Перемешайте и выдержите при комнатной температуре в течение пяти минут. Поместите трубки в устройство для резки ДНК для ультразвуковой обработки ДНК.
Вслед за добавлением фенола и хлороформа. Хорошо перемешайте, энергично поворачивая на максимально возможной скорости в течение 45-60 секунд. Переложите по три миллилитра полученной прозрачной верхней фазы из каждой пробирки в другую свежую 15-миллилитровую пробирку.
Добавьте 0,5 миллилитра трех моляров ацетата натрия и четыре миллилитра изопропанола и хорошо перемешайте. После центрифугирования пробирок в течение 30 минут при 7, 200 G и 20 градусах Цельсия и удаления надосадочной жидкости добавьте в гранулу 0,5 миллилитра 70% этанола и вытесните его пипетированием вверх и вниз. Соедините повторно суспендированные гранулы из обеих пробирок в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.
Выполните ПЦР-реакции, используя условия, показанные на экране. После второй реакции ПЦР объедините четыре образца в одну микроцентрифужную пробирку. И добавляем в него 80 микролитров загружающего красителя 6Х.
Визуализируйте гель и подтвердите полосу примерно на 250 парах оснований. Человеческие MPNST-клетки, трансдуцированные нецелевым контролем и лентивирусом, экспрессирующим четыре различные короткие РНК Bcl-6, показали, что некоторые из коротких РНК Bcl-6 заметно снижают количество клеток. Иммуноблоттинг показал, что степень снижения количества клеток коррелирует со степенью нокдауна Bcl-6.
