Para configurar el novedoso sistema de cultivo de flujo multicanal sin bomba, después de ensamblar el módulo de depósito de medios o MRM, inserte los conjuntos de tubos en él y coloque el MRM en el calentador. Después de asegurar el calentador en su lugar, proceda a insertar los conjuntos de la cámara de tejido o TCA en el módulo de la cámara de perfusión o PCM. Con la herramienta de inserción de TCA, inserte cada uno de los ocho TCA uno a la vez en los orificios del PCM.
Asegúrese de presionar firmemente el adaptador con la herramienta hasta que la parte superior del manguito del tubo alrededor de cada cámara toque la superficie que circunscribe los orificios del PCM. Coloque el PCM parcialmente ensamblado a un lado junto con la abrazadera del PCM y seis tornillos. 30 minutos después del montaje de la carcasa y después de que el MRM alcance la temperatura deseada, utilizando una pipeta de 50 mililitros, transfiera la perfusión preequilibrada al inserto MRM precalentado dispersando suavemente el líquido por los lados.
A continuación, para colocar el PCM en el MRM, inserte los tubos de resistencia TCA que emanan de la parte inferior del PCM en los insertos MRM, cuatro a cada lado del divisor MRM. Oriente el módulo de modo que las cámaras de tejido descansen contra el detector de oxígeno una vez colocado. Fije el PCM a la abrazadera de soporte con seis tornillos y el destornillador eléctrico.
A continuación, fije los TCA dentro de las aletas de soporte del PCM utilizando la banda elástica suministrada, estirándola alrededor de las aletas a la altura de las juntas de goma. Coloque el detector de oxígeno en el soporte del detector asegurándose de que su cara descanse contra las aletas del PCM. Alinee los pares de fotodetectores LED con el tinte sensible al oxígeno en las cámaras de tejido aflojando los tornillos colocados en el costado del soporte del detector y ajustando las guías laterales del detector si es necesario.
Finalmente, coloque la tapa en la parte superior de la carcasa. Para cargar el tejido en las cámaras, espere hasta que el nivel del medio esté a 0.5 pulgadas de la parte superior. Para cargar la retina extraída o la esclerótica coroidea del EPR, con pinzas de punta fina, coloque suavemente la retina sin doblarla en cada cámara.
Mientras tanto, use una toallita de papel para evitar que el líquido de la cámara de tejido gotee sobre el sensor de oxígeno. Deja que el pañuelo se hunda hacia y sobre el FRET. Para cargar las células del EPR en las membranas Transwell, después de pasar las células preparadas con EDTA al 0,25 % de tripsina, sembrarlas en filtros grabados con pistas de tereftalato de polietileno con un tamaño de poro de 0,4 milímetros.
El día del experimento, corte las membranas en tres tiras de igual ancho y cárguelas en las cámaras de tejido con pinzas. La tasa de consumo de oxígeno (OCR, por sus siglas en inglés) de la retina fue constante durante el tiempo en que se inyectaron los compuestos de prueba, lo que indica una salud y función estables del tejido y respalda la validez del método. De acuerdo con los datos obtenidos mediante los métodos convencionales de perfusión tanto para la retina como para la esclerótica coroidea del EPR, la OCR disminuyó en respuesta a la oligomicina y aumentó en respuesta a la FCCP.
Los cambios en la tasa de producción de lactato o LPR observados fueron inversos a los observados para la OCR. Las células del EPR, que no han sido analizadas previamente con sistemas de flujo, respondieron de manera similar a la esclerótica coroidea del EPR utilizando este método.
